轉(zhuǎn)蠟樣芽孢桿菌acdS基因改善煙草耐鹽性研究.pdf

1、煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，土地鹽堿化引起的土壤板結(jié)、利用率低等問(wèn)題一直制約著煙草在鹽堿地上的種植。植物受逆境脅迫時(shí)，乙稀含量升高且過(guò)量的乙稀會(huì)抑制植物生長(zhǎng)并對(duì)植物造成損害。ACC氧化酶(ACO)能氧化ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)從而生成乙稀，而acdS基因編碼的ACC脫氨酶(ACD)能通過(guò)水解 ACC，降低植物體內(nèi)乙稀的合成，有效緩解高濃度乙稀對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)室前期

2、研究結(jié)果顯示海濱錦葵內(nèi)生細(xì)菌蠟樣芽孢桿菌HK012(Bacillus cereusHK012)，具有較高ACC脫氨酶活性，接種于小麥等作物根系后，能顯著增強(qiáng)這些植物在高鹽脅迫下的抗性?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本文采用葉盤(pán)法將蠟樣芽孢桿菌HK012的acdS基因轉(zhuǎn)入煙草，獲得基因工程耐鹽煙草新品種，為提高煙草對(duì)鹽堿地的利用率提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。
　　論文從蠟樣芽孢桿菌HK012中克隆acdS基因，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建植物pMDC

3、45-acdS(2×35S-GFP-acdS-Nos)表達(dá)載體，并通過(guò)葉盤(pán)法將其轉(zhuǎn)入煙草中，根據(jù)重組質(zhì)粒攜帶的篩選標(biāo)記基因Hyg，用潮霉素濃度為15 mg/L的愈傷培養(yǎng)基(MS+1 mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA+500 mg/L Cefotaxime)進(jìn)行煙草不定芽的篩選，潮霉素濃度為10 mg/L的生根培養(yǎng)基(MS+250 mg/L Cefotaxime)進(jìn)一步篩選轉(zhuǎn)基因苗，獲得轉(zhuǎn)基因株。通過(guò) DNA水平、mRAN水平以

4、及蛋白質(zhì)表達(dá)水平(Western blot)檢驗(yàn)，表明acdS融合基因在煙草中獲得穩(wěn)定表達(dá)，熒光顯微鏡觀測(cè)顯示融合蛋白定位于煙草根系的細(xì)胞膜(或細(xì)胞壁)上。
　　對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草 T2代幼苗進(jìn)行耐鹽性檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草株高、根長(zhǎng)、干重、鮮重、葉綠素含量均大于未轉(zhuǎn)化煙草。脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果顯示，150mM NaCl、300mM NaCl濃度下轉(zhuǎn)基因煙草葉片中脯氨酸含量相對(duì)于未轉(zhuǎn)化煙草分別提高55.15％、42.70%。保護(hù)酶(

5、SOD、POD、CAT)活性測(cè)定結(jié)果顯示，當(dāng)NaCl濃度為150 mM時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草SOD、POD、CAT活性相對(duì)于未轉(zhuǎn)化煙草分別提高28.87%、21.57%、21.84%；當(dāng)NaCl濃度為300 mM時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草SOD、POD、CAT活性相對(duì)于未轉(zhuǎn)化煙草分別提高31.83%、32.24%、26.30%。ACC脫氨酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草ACC脫氨酶活性均大于未轉(zhuǎn)化煙草，在150mM NaCl、300mM NaCl濃度下轉(zhuǎn)基因