新城疫病毒F基因在真核及原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá).pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒引起的一種急性、高度接觸性禽類傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)定為法定必報(bào)傳染病，我國也將其列為一類動(dòng)物疫病。新城疫病毒(NDV)是副黏病毒科、副黏病毒亞科、禽病毒屬的成員，為有囊膜的負(fù)鏈RNA病毒，可存在于病禽的所有組織器官、體液、分泌物和排泄物中。長期以來，我國普遍開展了以接種疫苗為主的新城疫綜合防控措施，使得ND的爆發(fā)得以控制，但近年來ND的流行又出現(xiàn)的新的特點(diǎn)，

2、不表現(xiàn)特異性癥狀的ND病例日益增多，甚至于高抗體雞群也發(fā)生該病，許多學(xué)者認(rèn)為這些流行特點(diǎn)表明很可能是由變異或超強(qiáng)毒株引起。特別是近年來鵝源病毒新城疫變異株的出現(xiàn)，更引起人們對(duì)于非典型新城疫發(fā)病原因的興趣。 F蛋白也稱融合蛋白，其主要作用是病毒囊膜與易感細(xì)胞發(fā)生融合，為NDV感染細(xì)胞所必需，與NDV的致病性密切相關(guān)。F蛋白首先以無活性的前體F0形式存在，此時(shí)無融合活性，只有當(dāng)其被裂解產(chǎn)生F1和F2兩條多肽后，才使病毒具有感染力，其

3、中F1亞單位在病毒的抗原性及結(jié)構(gòu)和功能上起著重要的作用，是F蛋白主要抗原決定簇。 本研究采用分子生物學(xué)方法，將F基因在真核及原核系統(tǒng)中表達(dá)，為進(jìn)一步的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下： 1．應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出新城疫病毒F基因，將其克隆入pGEM-T Easy vector載體，進(jìn)行核苷酸測序測定。然后將其與高效的真核表達(dá)載體pcDNA4/HisMax相連，構(gòu)建重組質(zhì)粒pc4F，采用Superfect轉(zhuǎn)染試劑將pc4F轉(zhuǎn)入

4、COS-7細(xì)胞，并應(yīng)用細(xì)胞免疫組化法檢測其在細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，F(xiàn)基因表達(dá)成功。 2．以含有新城疫病毒F基因的重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)特異的引物，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得F基因的F1片段，經(jīng)BamHⅢ和Hind Ⅲ雙酶切，定向插入原核表達(dá)載體pET-28a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pETF1，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在其宿主菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中成功表達(dá)了分子質(zhì)量約31 ku的蛋白，SDS-PAGE和Western blot分析顯示，F(xiàn)