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1、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(Porcine circovirus, PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒?。≒orcine circovirus disease, PCVD)的主要病原,它能損害患病仔豬的免疫系統(tǒng),引發(fā)其他多種病原混合感染或繼發(fā)性感染,導(dǎo)致豬的繁殖能力嚴(yán)重下降,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2感染的早期診斷對(duì) PCVD的綜合防控具有重大意義。目前,針對(duì) PCV2病原的快速檢測(cè)方法主要有膠體金免疫層析試紙法和ELISA檢測(cè)方法等,其所用抗
2、體主要是基于雜交瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體,傳統(tǒng)單克隆抗體存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn),在一定程度上限制了 PCV2快速、高效、廉價(jià)的檢測(cè)方法的研制。而基因工程方法制備的單鏈抗體具有生產(chǎn)周期短,成本低、易于改造等優(yōu)點(diǎn),其有望取代傳統(tǒng)單抗用于 PCV2新型免疫學(xué)檢測(cè)方法的研制。實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容與結(jié)果如下:
1. PCV2 Cap蛋白的純化及鑒定
本實(shí)驗(yàn)將重組表達(dá)載體 pET28a-ORF2轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21中,
3、用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá),利用 Ni-NTA親和層析法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化,并對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示表達(dá)的重組蛋白分子量約26 kDa,主要以可溶形式存在,且能被 His單克隆抗體特異性識(shí)別,純化后的重組蛋白純度比較高。用此蛋白免疫 BALB/C鼠,免疫后,經(jīng) ELISA檢測(cè),測(cè)得鼠血清中抗體滴度達(dá)1∶64000,同時(shí)用 PCV2抗體檢測(cè)試紙對(duì)鼠血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果為陽性。本實(shí)驗(yàn)制備的重組 Cap蛋白具有可溶性好、純度高、免疫原性好等特點(diǎn),為
4、 Cap蛋白單鏈抗體庫的構(gòu)建提供了必要的實(shí)驗(yàn)材料。
2. PCV2 Cap蛋白噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建及淘選
選取免疫效果較好的小鼠脾臟,提取其脾臟總 RNA,再以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,PCR擴(kuò)增抗體的重鏈可變區(qū)基因(Heavy chain variable region of antibody, VH)和抗體的輕鏈可變區(qū)基因(Light chain variable region of antibody, VL)
5、,經(jīng)重疊PCR將VH與VL用多肽(G4S)3連接,獲得單鏈抗體基因(Single chain antibody variable region gene fragment, ScFv)。經(jīng)輔助噬菌體輔助侵染后獲得噬菌體單鏈抗體庫,用 Cap蛋白作為包被原篩選 PCV2單鏈抗體克隆,獲得3株與 Cap蛋白特異性反應(yīng)的噬菌體克隆。取特異性及反應(yīng)性相對(duì)較高的克隆測(cè)序,獲得 PCV2單鏈抗體基因,并用 ELISA鑒定 ScFv-P18菌株的誘導(dǎo)
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