MicroRNAs在橘小實(shí)蠅精子發(fā)育中的作用研究.pdf

1、橘小實(shí)蠅是廣泛分布于東亞和太平洋地區(qū)的最重要的園藝害蟲之一。在其防治策略中，雄性不育技術(shù)(SIT)具有高特異、環(huán)境友好的巨大優(yōu)勢(shì)，然而傳統(tǒng)的SIT依賴于輻照和化學(xué)不育劑，容易損傷不育雄蟲的交配競(jìng)爭(zhēng)力，從而限制了其防治效果。近年來(lái)，基于遺傳改造的SIT在橄欖實(shí)蠅的防治中表現(xiàn)優(yōu)異，顯示了在實(shí)蠅防治應(yīng)用中的巨大潛力。另一方面，microRNAs(miRNAs)作為一種負(fù)向調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，參與調(diào)控了各種生命過(guò)程，其中就

2、包括對(duì)精子發(fā)生的調(diào)控。因此，基于精子發(fā)生關(guān)鍵miRNA的遺傳改造技術(shù)對(duì)于SIT具有重要的開發(fā)價(jià)值。然而到目前為止，橘小實(shí)蠅中精子發(fā)生調(diào)控相關(guān)miRNA的研究還很缺乏。
　　本研究首先對(duì)性成熟期(FM)、初羽化（IM）、生殖前期(MA)橘小實(shí)蠅的精巢組織small RNA進(jìn)行了深度測(cè)序，并整合構(gòu)建了總small RNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)了172個(gè)已知和78個(gè)未知的miRNA，并分析了它們?cè)诰影l(fā)生過(guò)程中的表達(dá)動(dòng)態(tài)。然后，通過(guò)對(duì)三個(gè)發(fā)

3、育時(shí)期精巢組織small RNA轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行兩兩比較，分別發(fā)現(xiàn)了在FM與IM、FM與MA、IM與MA發(fā)育時(shí)期之間差異表達(dá)的24、15、14個(gè)精巢miRNA。通過(guò)生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步預(yù)測(cè)了13個(gè)轉(zhuǎn)錄差異最大的miRNA的124個(gè)靶標(biāo)基因，并從中隨機(jī)選擇了6個(gè)miRNA和其預(yù)測(cè)調(diào)控的基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證分析，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)miRNA與其靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄模式相反。
　　進(jìn)一步的，對(duì)這4個(gè)miRNA中的miR-8-3p調(diào)控精子發(fā)生的功能進(jìn)

4、行了深入研究。首先，我們預(yù)測(cè)出miR-8-3p的靶標(biāo)基因，B.dorsalis mitoferrin(bmfrn)，推測(cè)miR-8-3p通過(guò)負(fù)調(diào)控bmfrn來(lái)調(diào)節(jié)精子發(fā)生。接下來(lái)，我們通過(guò)HeLa細(xì)胞的dual-luciferase報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證了miR-8-3p通過(guò)結(jié)合bmfrn的3' UTR區(qū)抑制后者的表達(dá)。而且，miR-8-3p的類似物(antagomiR)或bmfrn的dsRNA注射處理都能顯著抑制mitoferrin的轉(zhuǎn)錄，減少