燕麥遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和披堿草再生體系的建立.pdf

1、本文擬研究燕麥(Oat)的組織培養(yǎng)及其植株再生，建立它們的遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)，把來(lái)自類產(chǎn)堿假單胞菌的殺蟲毒蛋白基因PPIP轉(zhuǎn)入燕麥，培育出具有抗蟲能力的牧草新材料；研究短芒披堿草(Elymus breviarjstatus)的組織培養(yǎng)及其植株再生，為將PPIP基因轉(zhuǎn)入短芒披堿草作好準(zhǔn)備。 建立了短芒披堿草的胚性愈傷組織誘導(dǎo)和再生體系。研究結(jié)果表明：外植體來(lái)源，和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合等是影響愈傷組織誘導(dǎo)和植

2、株再生的主要因素。分析比較了短芒披堿草成熟胚，下胚軸和幼葉三種來(lái)源的外植體，其中成熟胚的出愈率最高，平均達(dá)到了47.82％。短芒披堿草愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，最佳的激素組合為5mg/L 2,4-D+0.05mg/L KT+2mg/LABA。同時(shí)發(fā)現(xiàn)添加1mg/L 左右的酪蛋白水解液能夠明顯提高愈傷組織的生長(zhǎng)質(zhì)量，可以改善愈傷組織的質(zhì)量，提高愈傷組織的分化能力。繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)愈傷組織的分化有很大影響。從成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織

3、分化能力最強(qiáng)，可以達(dá)到48％左右。短芒披堿草最佳分化培養(yǎng)基是1/2MS基本培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽+B5有機(jī)物+NAA0.5mg/L+KT0.01 mg/L。 優(yōu)化了燕麥861再生體系：分析比較了該品種成熟胚，下胚軸和幼葉三種來(lái)源的外植體，其中成熟胚的出愈率最高，平均達(dá)到了64％。燕麥草愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，最佳的激素組合為4mg/L 2,4-D。從成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織分化能力最強(qiáng)，可以達(dá)到54.3％左右。燕麥最佳分化培養(yǎng)

4、基是1/2MS基本培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽+B5有機(jī)物+0.1mg/LKT和1.0mg/L6-BA。建立了燕麥抗性愈傷組織的篩選方案。較好的篩選劑是潮霉素，45mg/L潮霉素濃度可較好的燕麥愈傷組織的篩選。確定使用成熟胚誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織作為基因轉(zhuǎn)化的材料，并通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，把類產(chǎn)堿假單胞菌的殺蟲毒蛋白基因ppIP轉(zhuǎn)入繼代40d后的愈傷組織，用潮霉素篩選抗性愈傷組織，最后再生分化出抗性植株，篩選培養(yǎng)基配方為：MS+2,4-D5.0+KT0.05

5、+Hn45+Carb500。實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒為PCAMBIAl304雙元載體，其上有kam，hpt，gus和mGFP等基因，用特定的酶切去gus和.mGFP基因，然后把殺蟲毒蛋白基因ppIP連接上去。構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EH105，然后浸染已經(jīng)處理好的愈傷組織。農(nóng)桿菌浸染后的愈傷組織培養(yǎng)在共培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)6d后，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基篩選抗性愈傷組織，共培養(yǎng)基配方為：1/4MS+2,4-D5.0+80μMAS pH5.6最后通過(guò)PCR，RT