MG132對(duì)早期糖尿病腎病大鼠ERK1-2信號(hào)通路的作用研究.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一,其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,治療措施有限。目前認(rèn)為氧化應(yīng)激(ROS)、蛋白質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、血管緊張素Ⅱ以及多種細(xì)胞因子等因素均可激活絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinasepathway,MAPK)這一共同信號(hào)通路,從而導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2,即

2、 p44/42MAPK)是目前闡述最早、最主要的MAPK途徑。絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKP)是MAPK信號(hào)通路特異性負(fù)性調(diào)節(jié)因子,可通過(guò)對(duì)MAPK脫磷酸化調(diào)節(jié)從而使MAPK滅活。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MKP-1受泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin-proteasomepathway,UPP)的泛素化降解調(diào)節(jié),UPP可特異降解MKP-1,使其蛋白水平降低,對(duì)MAPK的滅活減少,MAPK信號(hào)通路激活?，F(xiàn)已公認(rèn),糖尿病腎病時(shí)MAPK活性增加而

3、MKP-1活性降低,但UPP是否通過(guò)降解MKP-1參與糖尿病腎病時(shí)MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道,蛋白酶體抑制劑是否能抑制糖尿病腎病MAPK信號(hào)通路的激活而具有治療糖尿病腎病的作用也值得關(guān)注。故本研究以鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)早期糖尿病腎病大鼠模型,以特異性蛋白酶體抑制劑MG132治療糖尿病腎病大鼠,通過(guò)尿蛋白、腎臟光鏡、電鏡、ERK1/2和MKP-1蛋白表達(dá)及纖維連接蛋白(FN)mRNA表達(dá)的研究,探討UPP在大鼠早期糖尿病腎病發(fā)

4、病中的可能作用機(jī)制及蛋白酶體抑制劑對(duì)糖尿病腎病的治療作用。方法；1、糖尿病大鼠模型的建立及分組:將50只健康雄性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為模型組(40只)和正常對(duì)照組(Normal control,NC組,10只)；模型組一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ,60mg/kg),對(duì)照組給予等體積的枸櫞酸緩沖液。模型組成模后隨機(jī)選取30只納入實(shí)驗(yàn)并隨機(jī)平均分成3組:①糖尿病+MG132高濃度治療組(MH組):MG132腹腔注射,

5、0.1mg/kg.d、②糖尿病+MG132低濃度治療組(ML組):MG132腹腔注射,0.05mg/kg.d和③糖尿病組(Diabetesmellitus,DC組)。DC組和NC組每天給予等體積的0.9％生理鹽水腹腔注射。2、于6周和8周時(shí)收集各組大鼠尿液檢測(cè)24小時(shí)尿微量白蛋白、尿蛋白/尿肌酐濃度比值；心臟采血檢測(cè)空腹血糖。3、腎臟組織病理檢查:清潔取腎,石蠟包埋,行HE和Masson染色,觀察腎小球和腎小管間質(zhì)纖維化變化。4、透射電

6、鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)變化:觀察腎小球和腎小管間質(zhì)情況。5、蛋白免疫印跡(Western-blot)檢測(cè)各組腎臟組織p-ERK1/2、t-ERK1/2及MKP-1蛋白表達(dá)。6、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)各組腎臟組織纖維連接蛋白(FN)mRNA表達(dá)。7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,各組間比較用單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn),組內(nèi)比較采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05

7、,P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、大鼠一般情況指標(biāo):①血糖:各模型組較NC組血糖升高(P<0.01)；MH組、ML組與DC組間血糖無(wú)明顯差異(P>0.05)；8周血糖與6周比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。②體重:與NC組相比,各模型組體重明顯減少(P<0.01),其中以DC組最為顯著；與DC組相比,MH、ML組體重增加(P<0.05)；與ML組比較,MH組體重增加(P<0.05)；各模型組8周體重較6周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.

8、05)。③24小時(shí)尿微量白蛋白(UAER)、尿蛋白/尿肌酐濃度(Up/Ucr)比值:與NC組相比,各模型組UAER及Up/Ucr均增加(P<0.05)；與DC組相比,MH組、ML組UAER及Up/Ucr降低(P<0.05)；MH組UAER及Up/Ucr較ML組減少(P<0.05)；8周和6周相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。2、HE染色:DC組、MH組、ML組腎小球體積增大,腎小管腫脹。Masson染色:NC組腎臟無(wú)明顯改變；DC組MH

9、組、ML組均可見(jiàn)腎小球系膜區(qū)異常物質(zhì)沉積,MH組較DC組輕,ML組與DC組相近；各組8周與6周比較無(wú)明顯差異。3、電鏡:各模型組均可見(jiàn)部分基底膜增厚不規(guī)則,內(nèi)皮細(xì)胞水腫,足突水腫或融合。以上改變?cè)贛H組、ML組較DC組輕,MH組較ML組輕；8周與6周相比無(wú)明顯變化。4、腎組織p-ERK1/2、t-ERK1/2和MKP-1蛋白表達(dá):①與NC組比較,各模型組總ERK1/2(t-ERK1/2)蛋白無(wú)明顯變化,而磷酸化ERK1/2(p-ERK1

10、/2)蛋白表達(dá)增高(P<0.05)；與DC組相比,MH、ML組p-ERK1/2蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；MH組較ML組減少(P<0.05)；各模型組8周p-ERK1/2表達(dá)與6周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。②與NC組比較,各模型組MKP-1蛋白表達(dá)均減少(P<0.05)；與DC組比較,MH、ML組MKP-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；MH組較ML組增加(P<0.05)；8周與6周相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5、

11、腎組織FN mRNA表達(dá):與NC相比,各模型組FN mRNA增加,以DC組明顯(P<0.01)；MH組、ML組表達(dá)較DC組減少(P<0.05)；MH組較ML組FN mRNA表達(dá)更少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；8周和6周相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:1、糖尿病腎病時(shí)MKP-1的泛素化降解增加使MAPK信號(hào)通路活化,參與了糖尿病腎病的發(fā)生。2、蛋白酶體抑制劑MG132可抑制MKP-1的泛素化降解,使MKP-1表達(dá)上調(diào),