利用生物工程技術培育高羊茅耐鹽耐旱新品系.pdf

1、高羊茅(Fescue arundinacea Schreb)是廣泛種植的多年生、開放授粉的優(yōu)良草坪草兼牧草，具有色美、抗寒、耐蔭、耐修剪等優(yōu)點，在我國北方地區(qū)多被用于建造草坪，但其葉片粗糙、生長緩慢、耐鹽性差及易受雜草危害等缺點限制了它的進一步推廣。開放授粉采用常規(guī)育種技術對高羊茅進行種質改良不僅周期長、成效低，而且缺乏必要的遺傳背景知識。植物細胞工程和基因工程技術的發(fā)展為改良高羊茅的耐鹽性及耐早性提供了一條新途徑。 本工作以高

2、羊茅無菌種子苗莖尖為材料，在附加適宜濃度6-BA和2,4-D的培養(yǎng)基上誘導叢生芽發(fā)生并繼代培養(yǎng)，建立起高效的叢生芽離體培養(yǎng)體系。 以叢生芽芽尖為受體，利用根瘤農桿茵(菌株LBA4404，攜帶mini-Ti質粒pCAMBIAl300。PIS-als)介導法將來源于玉米的PIS基因轉入高羊茅，獲得抗性芽。抗性芽頻率約為23.7﹪。抗性芽經(jīng)增殖后，轉移到生根培養(yǎng)基生根，移栽花盆成活率達到95﹪以上。對轉化植株DNA進行PCR和PCR-

3、Southem blotting檢測，證實PIS基因已轉入3個高羊茅品種中。對轉化參數(shù)進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)芽尖在OD<,600>=0.8-1.2的農桿菌菌液中浸染5分種，結合負壓(0.5×10<'5>pa)處理，然后共培養(yǎng)2天，經(jīng)抑菌和綠黃隆篩選后獲得抗性芽頻率較高。 本實驗室以繼代培養(yǎng)的叢生芽塊為材料，經(jīng)過連續(xù)加鹽篩選、后代選育，獲得了一批耐鹽株系。本工作對部分耐鹽株系進行了耐鹽耐旱性分析。移栽到沙盆中的材料經(jīng)不同濃度鹽水澆灌后，

4、隨NaCl濃度的提高，材料的增殖能力逐漸減弱，脯氨酸含量提高。與對照相比，株系L53和L98分蘗增殖能力受鹽脅迫影響較小。對移栽到土鹽中的材料進行干旱脅迫，并在脅迫不同時間取材測定生理指標，發(fā)現(xiàn)與對照相比，株系L53、Q71和L98葉片細胞膜受到的損傷程度較輕，葉綠素含量降低的速度較慢，表現(xiàn)出較對照好的耐早性，其它多項生理指標也支持了上述結論?？梢?，株系L53和L98耐鹽耐旱性比較好，可作為進‘步選育耐鹽耐旱高羊茅新品種的候選材料。

5、 另外對已獲得的轉betA的高羊茅株系進行了耐鹽耐旱性分析。以兩個基因型各三個轉基因株系和對照為材料，鹽處理時，逐漸增加鹽濃度，達到終濃度后維持終濃度20天左右，選取不同時間點取材測生理指標。干旱處理時，維持對材料適度脅迫即植株上午10時左右出現(xiàn)萎蔫，下午澆適量水后第二天早晨植株恢復正常，在脅迫不同時間點取材測定生理指標。通過分析轉基因材料的生物量、葉綠素含量、脯氨酸含量、質膜穩(wěn)定性等指標，可以看出轉基因植株比對照具有更好的耐鹽耐旱