人C5a新型受體（C5L2）N端突變體的功能研究.pdf

1、過敏毒素C5a是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)和趨化因子，在急性肺損傷、膿毒血癥、腦膜炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。C5a在體內(nèi)被羧肽酶作用后，其C-端第74位精氨酸(Arg)迅速地分離，而成為去精C5a(C5ades-Arg74)。C5a通過其受體-CD88和C5L2(C5alikereceptor-2)來實(shí)現(xiàn)生物學(xué)活性。C5a與CD88通過兩點(diǎn)模型相互作用后，介導(dǎo)一系列的炎癥反應(yīng)，如激發(fā)細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺，

2、增強(qiáng)血管通透性；誘導(dǎo)白細(xì)胞表達(dá)分泌IL-6等細(xì)胞因子。C5L2是C5a的新型受體，其最大的特點(diǎn)是與C5a/C5ades-Arg74呈高親和力結(jié)合，且不與G蛋白偶聯(lián)、無信號(hào)傳導(dǎo)的清道夫受體，它可能通過有效地結(jié)合過敏毒素(如：C5a/C3a/C4a等)在清除和降低炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮主要作用。目前C5a-C5L2相互作用的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合模型尚未揭曉，僅根據(jù)CD88的研究推測(cè)其也為兩點(diǎn)結(jié)合模型，且C5L2N端為主要的功能域，負(fù)責(zé)和絕大部分的配體結(jié)

3、合。尋找C5L2蛋白和C5a的結(jié)合位點(diǎn)，可以全面了解其功能，同時(shí)通過作用于該位點(diǎn)激活或促進(jìn)配受體的結(jié)合，理論上能夠阻斷或減少C5a-CD88的相互作用，從而降低C5a引起的炎癥反應(yīng)，為治療炎性相關(guān)疾病找到一條新的通路。 體外定點(diǎn)突變技術(shù)可以對(duì)某個(gè)區(qū)域內(nèi)的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變、缺失或插入，通過突變前后蛋白質(zhì)功能的變化來研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。本研究就是通過生物信息學(xué)分析C5L2與C5a的可疑結(jié)合位點(diǎn)，同源模建的方法預(yù)測(cè)C5L2三維

4、立體結(jié)構(gòu)；選取C5L2N端為研究對(duì)象，構(gòu)建多個(gè)突變體，通過原核表達(dá)野生型和突變型蛋白，利用生物傳感器檢測(cè)突變前后C5L2N端蛋白與C5a結(jié)合力的變化，從而初步定位與C5a發(fā)生相互作用的關(guān)鍵區(qū)域；再合成1條含有該位點(diǎn)的多肽，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該多肽拮抗炎癥的效應(yīng)，為進(jìn)一步研究C5L2的功能以及治療C5a相關(guān)疾病的研究奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.利用生物信息學(xué)技術(shù)分析C5L2結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其分子的跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)

5、結(jié)構(gòu)、親水性、可及性、柔韌性等；再通過同源模建的方法預(yù)測(cè)C5L2蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)。 2.利用基因重組技術(shù)和定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)野生型和突變型C5L2-N端重組體；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析法純化融合蛋白，最后經(jīng)凝血酶Xa酶切純化后，獲得純度較高的目的蛋白。 3.rhC5a包被于生物傳感器芯片，分別檢測(cè)原核表達(dá)的野生型和突變型蛋白與rhC5a的結(jié)合力。 4.合成1條含有結(jié)合位點(diǎn)的多肽，命名為D3，在體外預(yù)先

6、與rhC5a孵育30min后，加入中性粒細(xì)胞培養(yǎng)體系，培養(yǎng)4小時(shí)后，其細(xì)胞上清液經(jīng)ELISA檢測(cè)IL-6水平；復(fù)制小鼠內(nèi)毒素休克模型，通過對(duì)小鼠48h生存率的觀察，初步研究該多肽在體內(nèi)拮抗C5a的活性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.C5L2第3～22位、第179～183、第190～195位，第265～275位為其可能的配體結(jié)合域，由于C5L2N-端，尤其是以ASP12，15，18為中心的肽段呈現(xiàn)出高的親水性、柔韌性及可及性，使其成為

7、本次研究的對(duì)象。同源模建獲得了C5L2蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)；表面靜電勢(shì)能圖顯示：C5a表面氨基酸殘基富集正電荷，C5L2表面富集負(fù)電荷，二者可以通過正負(fù)電荷的吸引完成配受體的結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，以ASP為靶點(diǎn)，確定了5個(gè)突變位點(diǎn)，為進(jìn)行下一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 2.野生型表達(dá)載體經(jīng)PCR和酶切方法初步鑒定構(gòu)建成功，測(cè)序結(jié)果顯示目的片段插入正確，并命名為W；突變型表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果顯示突變位點(diǎn)為設(shè)計(jì)位點(diǎn)，我們將突變成功的2個(gè)缺

8、失突變體命名為D-1和D-2，3個(gè)點(diǎn)突變體分別命名為S-1，S-2和S-3。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了分子量約33kDa的野生型及突變型融合蛋白；親和層析技術(shù)獲得純度80％的融合蛋白；凝血酶Xa酶切純化后，得到了約為4kDa的目的蛋白。 3.rhC5a成功包被于生物傳感器芯片。R4、W與S-1、S-2均可與rhC5a結(jié)合，結(jié)合率分別為88％，86％，85％和81％，四組間無顯著性差異(P＞0.05)；S-3也可

9、與rhC5a結(jié)合，但結(jié)合率明顯下降，為21％，與前四組蛋白結(jié)合率有顯著性差異(P＜0.01)；而D-1、D-2則不與rhC5a發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，從而初步尋找到了與rhC5a結(jié)合位點(diǎn)密切相關(guān)的區(qū)域和關(guān)鍵的氨基酸殘基。 4.多肽D3能顯著減少rhC5a刺激后中性粒細(xì)胞產(chǎn)生IL-6(P＜0.01)；D3對(duì)LPS所致內(nèi)毒素休克小鼠具有明顯的保護(hù)作用，使D3治療組的生存率較對(duì)照組明顯提高(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.與