去除外源氨基酸的K5突變體設計與功能研究.pdf

1、血管增生(angiogenesis)是指在原有血管網(wǎng)基礎上形成新的毛細血管的過程。又被稱作為血管新生(neovascularization)。在創(chuàng)傷、月經(jīng)周期以及外周循環(huán)閉塞等情況下血管增生具有恢復血供和促進傷口愈合的積極作用。但更多的情況下，血管增生參與疾病的發(fā)生與發(fā)展。病理性血管增生見于糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、動脈粥樣硬化、慢性風濕性關節(jié)炎等多種疾病。病理性血管增生也在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復發(fā)過程中扮演了非常關鍵的角色，因

2、而阻斷或抑制血管增生是抗腫瘤治療的有效策略。近年來以血管增生為靶點治療腫瘤已成為腫瘤治療研究的熱點，有多種血管增生抑制劑相繼進進臨床試驗階段。
　　 人纖溶酶原裂解片段Kringle5(簡稱K5)是新近發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性血管增生抑制因子，是抗血管增生活性最強的人纖溶酶原(plasminogen Plg)裂解片段，包含了Plg中Pro452-Ala542之間氨基酸序列，約有91多個氨基酸殘基，表觀分子量約為16kDa。k5空間結(jié)構(gòu)由

3、一個完整的Kringle結(jié)構(gòu)域和兩側(cè)氨基酸臂組成，其中80個序列嚴格保守氨基酸殘基組成了Kringle結(jié)構(gòu)域，且該結(jié)構(gòu)域由3個二硫鍵連接而成。
　　 我們早期研究也證實了K5具有特異性抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和誘導內(nèi)皮細胞凋亡的作用；在視網(wǎng)膜血管增生和糖尿病大鼠模型中均發(fā)現(xiàn)K5能降低血管滲漏；在視網(wǎng)膜血管增生大鼠模型中我們進一步觀察到K5及其突變體能預防和阻斷新生血管的形成；同時應用相同來源的K5滴眼液證實K5亦可抑制兔角膜的血管增

4、生。最近本實驗室在HepA肝癌皮下種植瘤模型上觀察到K5能顯著降低腫瘤組織中微血管密度(microvessel density，MVD)和抑制腫瘤生長。同時還發(fā)現(xiàn)k5對某些高轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞(Bel7402肝癌細胞、PC-3-M高轉(zhuǎn)移性前列腺癌細胞、PG轉(zhuǎn)移性肺癌細胞和Lewis肺癌細胞轉(zhuǎn)移株等)的運動和遷移有明顯的抑制作用，并且在高轉(zhuǎn)移Lewis肺癌腫瘤模型上發(fā)現(xiàn)k5可以抑制Lewis肺癌細胞自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移。
　　 我們前期的研究

5、還發(fā)現(xiàn)其抗血管增生活性與kringle結(jié)構(gòu)域的完整性(三個二硫鍵的完整性)密切相關，并且發(fā)現(xiàn)k5-N端10個氨基酸缺失突變體的抗血管增生活性更強。而其N端含有5個的電負電荷的酸性氨基酸，有文獻報道Kringle結(jié)構(gòu)域內(nèi)與K5活性相關的“賴氨酸結(jié)合口袋”—其核心序列RKLYDY含兩個關鍵的帶正電荷的精氨酸殘基Arg69和賴氨酸殘基Lys70，去作Arg69和Lys70后，其活性消失。據(jù)于此我們前期的研究通過點突變技術(shù)將k5-N端5個酸性氨

6、基酸置換為中性氨基酸蘇氨酸，在原核表達系統(tǒng)表達了His標簽的k5突變體融合蛋白，結(jié)果在體外實驗中我們發(fā)現(xiàn)該突變體蛋白比k5的抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞生長增殖的活性更強。但是該突變體蛋白為融合蛋白，且含有23個外源氨基酸殘基，這制約了其今后在臨床上的運用。
　　 據(jù)于K5在體內(nèi)和體外實驗中表現(xiàn)出顯著抑制血管增生的作用，我們分析K5具備潛在的抑制惡性腫瘤和血管增生相關疾病的臨床運用價值。但K5完整多肽已獲美國專利(美國專利序號08/83

7、2，087，1997年4月3日，美國伊利諾伊州艾博特公司)和中國專利(公開號CN1223690A，1997年7月21日)保護。因而通過基因工程的方法構(gòu)建無外源氨基酸的K5的突變體不僅可以研究K5結(jié)構(gòu)與功能的關系，也可以制備具有自主知識產(chǎn)權(quán)的和具有潛在抑制腫瘤和血管增生性疾病的基因工程藥物。
　　 本研究利用pGEX-4T-1/BL21(DE3)原核表達系統(tǒng)優(yōu)化引物設計得到去除外源氨基酸的K5突變體，同時對K5-N端5個酸性氨基酸

8、進行突變。本研究將在體內(nèi)和體外實驗中分析K5-N端5個帶負電的酸性氨基酸殘基與其抗血管增生活性之間的關系，進一步明確K5結(jié)構(gòu)與功能的關系；同時為制備具有抑制血管增生和抗腫瘤作用的無外源氨基酸K5m5基因工程蛋白藥物提供技術(shù)方案。開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的和具有潛在抑制腫瘤和血管增生性疾病的基因工程藥物打下堅實基礎。
　　 研究目標
　　 1、通過pGEX-4T-1/BL21(DE3)原核表達系統(tǒng)獲得去除外源氨基酸的K5突變體

9、k5m5蛋白。
　　 2、體內(nèi)和體外實驗證實無外源氨基酸的K5突變體k5m5蛋白具有抑制血管增生的活性和抑制裸鼠肝癌實體瘤的生長的作用。
　　 研究內(nèi)容與結(jié)果
　　 第一部分：獲得分子量更小、無外源氨基酸序列、高純度的k5m5蛋白
　　 (1)pGEX-4T-1/k5m5重組質(zhì)粒的構(gòu)建。以我們實驗室構(gòu)建保存的pET22b(+)/k5mut5cDNA為模板，設計引物(正向引物：CGT GGATCCCCATC

10、TGTATCGACTCCTTCC;反向引物：5'-CCG CTCGAG TCA CGC ACACTG AGG GAC-3')，采用PCR法得到K5m5基因。利用基因工程技術(shù)，將目的基因克隆至pGEX-4T-1的BamHI和XhoI位點。測序結(jié)果表明目的基因片段與pGEX-4T-1連接無誤，閱讀框架正確，pGEX-4T-1/k5m5重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 (2)GST-k5m5融合蛋白的表達、純化。鑒定正確的pGEX-4T-1/

11、k5m5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)宿主菌中，BL21(DE3)/pGEX-4T-1/k5m5工程菌37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達0.6，0.6nmol/l的IPTG25℃低溫誘導6h～10h，表達出可溶性重組蛋白。誘導表達的細菌經(jīng)超聲后，離心取上清，用GST親和柱Glutathione Sepharose4B純化，獲得高純度可溶性融合蛋白。對純化的融合蛋白進行SDS-PAGE電泳和Western-blot分析鑒定，結(jié)果顯示得到分子量

12、約為37kDa的GST-k5m5融合蛋白。
　　 (3)凝血酶切割GST-k5m5融合蛋白后的再次分離純化。用凝血酶對融合蛋白進行切割，用GST親和柱Glutathione Sepharose4B去除GST標簽后，采用超濾方法分離獲得k5m5蛋白。得到的蛋白經(jīng)抗k5血清Western-blot分析顯示有明顯的免疫雜交帶。
　　 第二部分：體內(nèi)和體外實驗驗證k5m5蛋白具有抗血管增生活性和抑制裸鼠肝癌實體瘤生長的作用

13、>　　 (1)K5m5蛋白特異性地抑制HUVECs的增殖MTT增殖實驗分析發(fā)現(xiàn)k5m5特異性抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的增殖，并呈明顯的濃度依賴關系。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)k5m5蛋白比k5蛋白具有更強的抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖作用。用80～1280nmol/L k5m5蛋白分別處理正常肝細胞(chang live cell)、肝癌細胞(Bel7402)與P

14、BS對照組細胞相比，各處理組細胞存活率變化無顯著差別。k5m5蛋白對正常肝細胞、肝癌細胞(Bel7402)的生長增殖無明顯作用。間接說明K5m5抑制HUVECs的增殖具有特異性。
　　 (2)K5m5蛋白誘導HUVECs凋亡，而對正常肝細胞、肝癌細胞(Bel7402)無誘導凋亡的作用
　　 Annexin V-PI雙染法標記凋亡細胞，流式細胞儀分析K5m5蛋白誘導HUVECs凋亡，而對正常肝細胞、肝癌細胞(Bel7402

15、)無誘導凋亡的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度為320nmol/L k5m5處理組內(nèi)皮細胞凋亡率顯著地高于PBS對照組，表明k5m5具有誘導內(nèi)皮細胞凋亡的作用。而80～1280nmol/L各濃度的k5m5蛋白處理組對正常肝細胞和肝癌細胞(Bel7402)的凋亡與陽性對照組和陰性對照組相比，沒有表現(xiàn)出能明顯誘導凋亡的作用。
　　 (3)K5m5蛋白抑制裸鼠肝癌(Bel7402)實體瘤生長的效應接種Bel7402肝癌細胞后第24天，肉眼可見PBS

16、對照組與k5m5處理組及k5處理組裸鼠頸背部皮下腫瘤生長體積大小出現(xiàn)差異。自腹腔注射k5m5第一次起連續(xù)觀察32天后處死裸鼠，剝瘤稱重，計算和比較各組瘤均重，結(jié)果顯示：k5m5蛋白及k5蛋白總劑量均為12.5mg/kg時，對BALB/c裸鼠肝癌(Bel7402)實體瘤生長具有顯著的抑制作用，抑瘤率分別為68％、63.8％。說明k5m5蛋白比k5蛋白具有更強的抑制裸鼠肝癌實體瘤生長的效應。
　　 (4)K5m5蛋白抑制裸鼠肝癌(B

17、el7402)實體瘤血管增生采用抗血管內(nèi)皮細胞CD34抗體，用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化氫酶(SP免疫組織化學方法)法進行鑒定，DAB顯色，蘇木素染核，棕黃色環(huán)狀物為血管陽性表達。結(jié)果表明K5m5處理組和k5處理組均降低腫瘤組織中微血管的密度(MVD)。但k5m5蛋白處理組的抑制作用更強。
　　 結(jié)論及意義
　　 1、成功構(gòu)建了pGEX-4T-1/k5m5重組質(zhì)粒，并獲得無外源氨基酸序列的基因工程蛋白k5m5。為其功能研

18、究打下基礎。
　　 2、無外源氨基酸序列的k5m5蛋白有抑制血管內(nèi)皮細胞生長增殖和誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡的活性。k5m5蛋白具有抑制血管增生性疾病的潛在價值。
　　 3、無外源氨基酸序列的k5m5蛋白具有抑制裸鼠肝癌實體瘤生長的作用。可以為肝癌等惡性腫瘤的治療提供新的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的有效候選基因工程藥物。
　　 4、體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)無外源氨基酸序列的k5m5蛋白比K5蛋白具有更強的抑制血管增生活性和抑制腫瘤生長的