梨S基因cDNA芯片雜交條件優(yōu)化及對梨品種S基因鑒定.pdf

1、梨屬于薔薇科蘋果亞科梨屬植物，是典型的配子體自交不親和性植物（GSI），其自交不親和性由單一基因位點(diǎn)的S-RNase復(fù)等位基因（S基因）所控制。在梨栽培中必須配以不同的S基因型授粉品種才能保證授粉座果的順利進(jìn)行。梨品種S-RNase基因的鑒定可以為梨栽培過程中授粉品種的準(zhǔn)確配置和育種過程中親本的合理選擇提供理論依據(jù)。我國梨品種S基因型復(fù)雜，不管是地方栽培品種還是野生型個體都蘊(yùn)含著豐富的S基因資源。為完善梨S基因鑒定的技術(shù)體系，加快梨品種

2、S基因資源挖掘與梨品種S基因型鑒定的進(jìn)程，本文制備了梨S-RNase基因cDNA芯片并對芯片系統(tǒng)檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化，利用S-RNase基因cDNA芯片并行檢測的特點(diǎn)快速準(zhǔn)確鑒定了部分梨品種S基因型、挖掘新的S基因資源并對新挖掘的S基因資源進(jìn)行分離鑒定和分子進(jìn)化分析。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)S基因cDNA芯片制備。根據(jù)存在于東方梨品種中已知的S1-S10、S12-S13、S15-S22、S25-S32和S34-S52的序列特征

3、及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以各S等位基因包含HV區(qū)的PF-PR1 mRNA序列作為cDNA探針，研制了S基因cDNA檢測芯片;實現(xiàn)了利用S基因芯片檢測系統(tǒng)快速檢測梨品種S基因的準(zhǔn)確性和可靠性。
　　(2)S基因cDNA芯片雜交體系優(yōu)化。獲得芯片最佳雜交條件為:最佳雜交溫度42℃，最適雜交時間8～9 h，最適PCR純化產(chǎn)物終濃度為200 ngμl-1，洗滌條件:2×SSC+0.1％SDS、0.1×SSC+0.1％ SDS、0.1×SSC溶液依次避

4、光洗滌3min，蒸餾水沖洗2～3次（每次不超過10s），玻片甩干機(jī)離心機(jī)干燥玻片。
　　(3)50個梨品種S基因型鑒定。利用S基因cDNA芯片優(yōu)化雜交體系完成了對50份不同種質(zhì)資源梨品種（主要是砂梨品種）S基因鑒定，確定了各品種的S基因型。優(yōu)化后的S基因芯片檢測系統(tǒng)能成功鑒定出砂梨品種所含有已知的S基因資源，同時根據(jù)芯片雜交信號可推測品種中新S基因的存在。
　　(4)分離和鑒定了梨7個新S等位基因。對芯片系統(tǒng)鑒定只含有1個雜

5、交信號、無雜交信號的品種，輔以酶切和DNA測序，從砂梨品種中分離獲得了PpS53(P.Pyrifolia S53)、PpS54、PpS55、PpS56、PpS57、PpS58、PpS59等新S等位基因的序列，均已登錄到GenBank數(shù)據(jù)庫。
　　(5)7個新S基因資源的進(jìn)化分析。利用砂梨品種S基因和薔薇科其它植物的S基因DNA序列研究了砂梨S基因的序列多態(tài)性和分子進(jìn)化關(guān)系，確定7個新S基因間及與薔薇科其它植物的S基因間的進(jìn)化關(guān)系。