P190蛋白胞外disc結(jié)構(gòu)域的體外表達(dá)純化及其互作蛋白的篩選鑒定.pdf

1、P190蛋白是一種單次跨膜糖蛋白，由1384個(gè)氨基酸組成，分子量約為190KD。P190大多表達(dá)于脊椎動物腦內(nèi)，主要存在于中樞及外周神經(jīng)的有髓神經(jīng)纖維郎飛結(jié)結(jié)旁區(qū)的軸膜上，其在卵巢、胰臟、腸、肺、心臟及睪丸等組織內(nèi)也有少量表達(dá)。對P190氨基酸序列的分析表明，P190胞外的區(qū)域較長（共計(jì)1264個(gè)氨基酸），含有1個(gè)FactorⅧ/discoidin(disc)結(jié)構(gòu)域，2個(gè)重復(fù)的表皮生長因子結(jié)構(gòu)域，4個(gè)層粘連蛋白G結(jié)構(gòu)域，1個(gè)纖維蛋白原類

2、似結(jié)構(gòu)域，以及1個(gè)脯氨酸-甘氨酸-酪氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域；P190蛋白的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域很短（共計(jì)80個(gè)氨基酸），含有band4.1蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域及富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域。研究表明，P190的主要功能是與contactin蛋白形成復(fù)合物，富集在神經(jīng)細(xì)胞軸突結(jié)旁區(qū)細(xì)胞膜上，與NF155等結(jié)合，在朗飛結(jié)的兩側(cè)形成一系列胞質(zhì)環(huán)。此連接區(qū)能使髓鞘錨定于軸突，從而有助于髓鞘的絕緣和神經(jīng)沖動的有效傳遞。有研究顯示，小鼠中若缺乏P190可引起結(jié)旁軸突與膠質(zhì)細(xì)胞

3、相互作用的喪失及神經(jīng)傳導(dǎo)速度的減慢；P190的異常表達(dá)可產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，P190敲除小鼠不僅神經(jīng)沖動傳導(dǎo)速度明顯低于野生型小鼠，而且在出生后不久就會因神經(jīng)元變性壞死而死亡。另有文獻(xiàn)報(bào)道，P190表達(dá)降低可導(dǎo)致神經(jīng)纖維脫髓鞘病變，加速軸突的變性壞死。
　　 本實(shí)驗(yàn)室首次在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human brain microvascular endothelialcells，HBMEC)中檢測到了P190蛋白的表達(dá)，進(jìn)

4、一步的研究結(jié)果提示P190可能作為受體參與調(diào)控HBMEC緊密連接的裝配，但其涉及的機(jī)制尚不清楚。因此，為了進(jìn)一步探討P190在HBMEC中的功能及其涉及的機(jī)制，本研究利用原核表達(dá)體系，對P190胞外段的disc結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了體外表達(dá)及純化；并利用酵母雙雜交技術(shù)，在人胎腦cDNA文庫中篩選能夠與P190胞外段的disc結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用的蛋白并進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，以期為P190的功能研究及其涉及的分子機(jī)制積累科學(xué)資料。
　　 方法：

5、r>　　 1、PCR擴(kuò)增P190胞外段disc結(jié)構(gòu)域編碼基因，利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體；
　　 2、將原核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，以IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況，利用親和層析方法對表達(dá)蛋白進(jìn)行純化；
　　 3、以P190胞外段disc結(jié)構(gòu)域作為誘餌蛋白，利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建酵母質(zhì)粒pGBKT7-P190disc，轉(zhuǎn)化入AH109酵母細(xì)胞，利用酵

6、母雙雜交技術(shù)在人胎腦cDNA文庫中篩選與P190disc結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白；
　　 4、分析酵母雙雜交的結(jié)果，選擇感興趣的目的蛋白，進(jìn)一步驗(yàn)證P190胞外段disc結(jié)構(gòu)域與該目的蛋白的相互作用。
　　 結(jié)果：
　　 1、獲得了P190disc結(jié)構(gòu)域的編碼基因，構(gòu)建了用于原核表達(dá)的重組質(zhì)粒pGEX-4T-3-P190disc;
　　 2、在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)了GST融合的P190disc蛋白，并利

7、用親和層析方法純化得到了GST融合的P190disc蛋白；
　　 3、利用酵母雙雜交方法在人胎腦cDNA文庫中篩選出14個(gè)與P190disc結(jié)構(gòu)域結(jié)合的陽性克??；
　　 4、選擇CD24作為目的蛋白，在酵母體內(nèi)證實(shí)了P190disc結(jié)構(gòu)域與CD24的相互作用；
　　 5、以293T細(xì)胞作為模式細(xì)胞，利用免疫熒光共定位技術(shù)發(fā)現(xiàn)CD24與P190disc結(jié)構(gòu)域有明顯的共定位；
　　 6、RT-PCR方法證實(shí)C