幽門螺桿菌HP0596的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種微需氧的革蘭氏陰性菌，主要寄生在人胃粘膜表面的黏液層，可以導(dǎo)致慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃腺癌和胃淋巴瘤等胃部疾病，被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌因子(TypeⅠ carcinogen)。目前臨床上的治療主要采用抗生素的手段，但是又存在著諸多的缺點，因此疫苗的開發(fā)也就有著重要的意義。而現(xiàn)在研究中的抗原比如幽門螺桿菌的全菌破碎物、尿素酶、過氧化氫酶等都不是十分理

2、想，所以尋找出新的具有保護性的候選抗原極具意義。
　　 我們之前通過生物信息學(xué)的分析等手段篩選出候選基因hp0596，分析其具有脂蛋白框，是一種可能的膜蛋白。然后我們通過血清學(xué)檢測出HP0596與胃炎、胃癌呈現(xiàn)出相關(guān)性，是H.pylori導(dǎo)致胃部疾病的相關(guān)致病因子。同時先前的研究初步證實HP0596可以通過NF-κ B途徑刺激巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α)。因此，本研究旨在通過對HP0596蛋白的定位的研究和細胞因子變

3、化等方面來闡述其相關(guān)的功能。
　　 首先，我們由H.pylori26695基因組中擴增hp0596及其信號肽的序列，并且將信號肽序列連接到增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的序列，將其克隆至表達載體pET22b(+)上，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞E.coli BL21(DE3)中，在經(jīng)過IPTG的誘導(dǎo)后均實現(xiàn)了表達。通過熒光共聚焦顯微鏡觀察EGFP激發(fā)出的熒光顯示目的重組蛋白定位在膜上。我們通過提取重組菌pET-22b/HP0596的周質(zhì)蛋白

4、和培養(yǎng)基上清蛋白進行western blot分析，證實了之前分析的準(zhǔn)確性。
　　 通過構(gòu)建去掉信號肽序列的HP0596N，和將HP0596N的兩個半胱氨酸(Cys)突變成極性相近，結(jié)構(gòu)相似的絲氨酸(Ser)，命名為HP0596NT，隨后克隆至pET22b(+)然后轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，經(jīng)過IPTG的誘導(dǎo)后均得到了表達，然后采用鎳柱親和層析的方法來純化目的蛋白，獲得目的蛋白的純度在90％以上。最后應(yīng)用所純化的HP0596N蛋