Caveolin-1調(diào)控頭頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜而且有多步驟參與的過(guò)程。近年來(lái)研究表明：上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)與上皮源性腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)，并且TGF-β1介導(dǎo)的信號(hào)通路在惡性腫瘤細(xì)胞EMT中發(fā)揮了十分重要的作用，如果能找到一種關(guān)鍵基因調(diào)控TGF-βi介導(dǎo)的信號(hào)通路，阻止EMT形成，將可能有效地控制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：Caveolin-1在頭頸鱗癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。為了探討Ca

2、veolin-1在頭頸鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用及其調(diào)控的分子機(jī)制，本課題首先制備了慢病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)和Caveolin-1干擾的重組慢病毒；利用Caveolin-1干擾慢病毒下調(diào)人頭頸鱗癌細(xì)胞株Tu686中Caveolin-1的表達(dá)，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察它對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)以及表型的影響；并通過(guò)活化TGF-β1信號(hào)通路后，分別上調(diào)、下調(diào)Caveolin-1的表達(dá)，對(duì)Caveolin-1調(diào)控TGF-β1信號(hào)通路在頭頸鱗癌細(xì)胞EMT及侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制進(jìn)行

3、探討，從而為頭頸鱗癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為以下三部分：
　　 第一部分 Caveolin-1過(guò)表達(dá)和干擾慢病毒載體的構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建Caveolin-1過(guò)表達(dá)和Caveolin-1干擾慢病毒載體
　　 方法：利用引物擴(kuò)增Caveolin-1 cDNA和線上設(shè)計(jì)合成針對(duì)Caveolin-1靶基因的干擾序列shRNA；將二者分別與病毒載體連接，將載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌并鑒定陽(yáng)性克隆，證實(shí)載體構(gòu)建成

4、功；利用慢病毒包裝試劑盒將包含Caveolin-1過(guò)表達(dá)和干擾cDNA序列的病毒載體和包裝載體共感染包裝細(xì)胞，經(jīng)回收、純化得到Caveolin-1過(guò)表達(dá)和干擾的重組慢病毒。
　　 結(jié)果：測(cè)序結(jié)果證明：包含Caveolin-1cDNA過(guò)表達(dá)和干擾序列的慢病毒載體構(gòu)建成功，得到Caveolin-1過(guò)表達(dá)和干擾重組慢病毒。
　　 第二部分沉默Caveolin-1基因?qū)︻^頸鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及遷移侵襲能力的影響<

5、br>　　 目的：觀察沉默Caveolin-1基因?qū)︻^頸鱗癌細(xì)胞表型及生物學(xué)行為的影響
　　 方法：用慢病毒Caveolin-1 shRNA感染Tu686細(xì)胞，經(jīng)篩選獲得Caveolin-1基因沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞；并用半定量PCR、Weatern-blot檢測(cè)Caveolin-1 mRNA和蛋白表達(dá)變化；CCK8檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡的情況；顯微鏡下觀察細(xì)胞表型形態(tài)的變化；Western-blot檢測(cè)細(xì)

6、胞表型相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin的變化；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力的變化。
　　 結(jié)果：慢病毒質(zhì)粒干擾Tu686細(xì)胞后，證實(shí)重組慢病毒Caveolin-1 shRNA感染效率高達(dá)90％以上；篩選出Tu686Caveolin－1 RNAi＋基因沉默細(xì)胞株和Tu686Caveolin－1 RNAi－陰性對(duì)照細(xì)胞株；CCK8和流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡情況與對(duì)照組細(xì)胞

7、相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞有偽足伸出，細(xì)胞間隙增寬；Western-blot結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞較陰性對(duì)照細(xì)胞上皮性標(biāo)志物E-cadherin蛋白水平明顯下調(diào)，間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)：劃痕愈合實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞較陰性對(duì)照細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)，24小時(shí)劃痕愈合率分別為(55.50±5.6)％、(24.20±2.5)％(P＜0.05)；Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)

8、驗(yàn)組細(xì)胞較陰性對(duì)照細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)，48小時(shí)穿過(guò)基底膜細(xì)胞數(shù)分別為103±15、34±4(P＜0.05)。
　　 第三部分 Caveolin-1調(diào)控 TGF-β1信號(hào)通路對(duì)頭頸鱗癌細(xì)胞侵襲能力的影響
　　 目的：觀察Caveolin-1對(duì)TGF-β1信號(hào)通路的調(diào)控作用及頭頸鱗癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響
　　 方法：利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)在Tu686細(xì)胞中進(jìn)行免疫細(xì)胞雙染，檢測(cè)TGF-βRⅠ與Caveolin-1

9、在細(xì)胞內(nèi)定位情況；Western-blot檢測(cè)沉默Caveolin-1基因?qū)嶒?yàn)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞中TGF-β1下游蛋白分子Smad2和其磷酸化產(chǎn)物p-Smad2的表達(dá)的表達(dá)；TGF-β1刺激Tu686細(xì)胞48小后，利用Caveolin-1過(guò)表達(dá)慢病毒感染細(xì)胞，Western-blot檢測(cè)Caveolin-1基因表達(dá)以及對(duì)TGF-β1信號(hào)通路下游蛋白表達(dá)的變化情況，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移能力的變化。
　　 結(jié)果

10、：細(xì)胞免疫熒光雙染結(jié)果顯示：TGF-β1受體TGF-βRⅠ與Caveolin-1共定位于Tu686細(xì)胞膜上；沉默Caveolin-1基因?qū)嶒?yàn)組細(xì)胞中p-Smad2的表達(dá)較陰性對(duì)照組細(xì)胞明顯上調(diào)(P＜0.05)，而總Smad2的表達(dá)并沒(méi)有明顯的變化(P＞0.05)；隨著TGF-β1劑量的增加，Tu686細(xì)胞Caveolin-1的表達(dá)逐漸下調(diào)(P＜0.05)，p-Smad2的表達(dá)則逐漸上調(diào)(P＜0.05)，而總的Smad2的表達(dá)沒(méi)有明顯變化

11、(P＞0.05)；Caveolin-1過(guò)表達(dá)慢病毒Caveolin-1 cDNA感染TGF-β1活化Tu686細(xì)胞后，細(xì)胞中p-Smad2的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)，而總的Smad2的表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05)，侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著下降(P＜0.05)。本研究得出如下結(jié)論：
　　 1.Caveolin-1對(duì)頭頸鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞周期和凋亡沒(méi)有明顯的影響；
　　 2.Caveolin-1可以誘導(dǎo)頭頸鱗癌細(xì)胞發(fā)生上皮