羊種布魯氏菌043強毒株BR0524、BRA0434基因缺失突變株的構(gòu)建與毒力的初步評價.pdf

1、布魯菌?。˙rucellosis）是由布魯菌屬（Brucella）引起的一種在全世界范圍內(nèi)廣泛流行、以侵害人類和動物生殖系統(tǒng)為主要特征的細菌性人畜共患傳染病。近年來，布魯氏菌相關(guān)毒力因子的研究已成為國內(nèi)外研究的重點和熱點，然而，關(guān)于布魯氏菌具體的致病機制和毒力因子的具體數(shù)量與功能等方面仍不十分清楚，這嚴重制約了抗菌藥物和疫苗的研發(fā)。前期，本研究室采用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)等方法將羊種布魯氏菌043強毒株與豬種布魯氏菌1330標準株、S

2、2菌苗株的全基因組 DNA進行了全面的對比分析和研究，有趣的是，我們發(fā)現(xiàn) BR0524和 BRA0434基因在 S2菌苗株的基因組 DNA上是不存在的，而在043強毒株與1330標準株的基因組 DNA上均有該兩個基因的存在，而且，目前在國內(nèi)外的研究中尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)該兩個基因的功能的報道。為此，本文以此發(fā)現(xiàn)作為出發(fā)點，初步探討 BR0524和 BRA0434基因?qū)ρ蚍N布魯氏菌043毒力的影響，這將為進一步研究該兩個基因在布魯氏菌中的功能提供

3、理論支持與科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)將本文所做的主要工作與成果匯總?cè)缦拢?br>　　1.羊種布魯氏菌043株 BR0524、BRA0434基因缺失突變株的構(gòu)建及鑒定。以羊種布魯氏菌043為模板分別高保真擴增 BR0524和 BRA0434基因的同源臂，以 pUC19K質(zhì)粒為模板高保真擴增卡那霉素抗性基因；通過融合 PCR的方法將上述獲得的片段融合到一起，以 pMD18-T Simple載體為骨架構(gòu)建重組質(zhì)粒，將其電轉(zhuǎn)化至羊種布魯氏菌043感受態(tài)細胞，

4、并對抗性克隆進行篩選和鑒定。結(jié)果顯示：經(jīng)過對抗性克隆進行篩選和菌液 PCR鑒定之后，最終獲得了羊種布魯氏菌043ΔBR0524、ΔBRA0434缺失突變株，并且，該兩株缺失突變株在15代內(nèi)未發(fā)生回復(fù)性突變現(xiàn)象，遺傳性穩(wěn)定。
　　2.生長特性的檢測。將ΔBR0524、ΔBRA0434與羊種布魯氏菌043分別接種于布魯氏菌液體培養(yǎng)基中，以每2h作為時間點，分別測定其 OD值的變化情況，直至細菌的生長速度進入平臺期，并分別繪制ΔBR05

5、24、ΔBRA0434與羊種布魯氏菌043的生長曲線。結(jié)果顯示：ΔBR0524、ΔBRA0434的生長曲線均與羊種布魯氏菌043趨于一致，即差異不顯著（P＜0.05）。
　　3.ΔBR0524毒力的初步評價。將ΔBR0524、羊種布魯氏菌043和 M5與小鼠巨噬細胞為100:1的感染比例（即 MOI=100:1）侵染小鼠巨噬細胞（RAW264.7），并以106 CFU劑量腹腔接種小鼠，進行體內(nèi)感染試驗。結(jié)果顯示：與羊種布魯氏菌04

6、3相比，ΔBR0524的毒力幾乎沒有下降（P＜0.05），并且，對小鼠脾臟重量變化的影響也趨于一致（P＜0.05）。
　　4.ΔBRA0434毒力的初步評價。將ΔBRA0434、羊種布魯氏菌043和 M5與小鼠巨噬細胞為100:1的感染比例（即 MOI=100:1）侵染小鼠巨噬細胞（RAW264.7），并以106 CFU劑量腹腔接種小鼠，進行體內(nèi)感染試驗。結(jié)果顯示：與羊種布魯氏菌043相比，ΔBRA0434的毒力有所下降，并且，對