4株布魯氏菌弱毒株對(duì)小鼠毒力及免疫保護(hù)力的評(píng)價(jià).pdf

1、布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種廣泛流行的、人畜共患的慢性傳染性疾病，不僅給畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重危害著人類健康；另外，布魯氏菌還被用作生物恐怖武器，對(duì)國(guó)家安全世界的和平造成嚴(yán)重的威脅。近年來(lái)布病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，布魯氏菌病的發(fā)病特點(diǎn)是一旦發(fā)病并轉(zhuǎn)入慢性就無(wú)法徹底治療。目前，接種疫苗是預(yù)防和控制布魯氏菌病流行的主要措施和手段。我國(guó)現(xiàn)有獸用布魯氏菌疫苗菌株有3種，分別為羊種布魯氏菌M5弱毒株、豬

2、種布魯氏菌S2弱毒株和牛種布魯氏菌S19弱毒株。20世紀(jì)70-90年代，這3種疫苗對(duì)我國(guó)布病疫情的防控起了至關(guān)重要的作用，迄今為止，這3種疫苗在我國(guó)仍然被廣泛使用，在一些歐美國(guó)家粗糙型流產(chǎn)布魯氏菌疫苗RB51(B. abortus RB51)主要應(yīng)用于牛布病的防治，并且被廣泛應(yīng)用，然而布魯氏菌病疫苗在不同國(guó)家、不同地區(qū)的應(yīng)用和報(bào)道不一，本實(shí)驗(yàn)對(duì)目前市場(chǎng)化的4株疫苗進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐提供一定的指導(dǎo)作用；同時(shí)由于RB51弱毒株的突變基

3、因尚不明確，因此對(duì)RB51與LPS相關(guān)的27個(gè)主要毒力基因進(jìn)行測(cè)序分析，旨在為新型疫苗的研究提供一定的參考。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴4種布魯氏菌弱毒株對(duì)小鼠毒力及免疫保護(hù)力的評(píng)價(jià)。為系統(tǒng)比較我國(guó)現(xiàn)有布魯氏菌病疫苗株S19，M5和S2及國(guó)外廣泛應(yīng)用疫苗株RB51的毒力及免疫保護(hù)力的強(qiáng)弱，本實(shí)驗(yàn)以上述4種疫苗株分別進(jìn)行了以100:1的 MOI侵染小鼠巨噬細(xì)胞的胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在胞內(nèi)存活能力RB51>M5>S19>S2；以1×10

4、6CFU/只免疫昆明小白鼠，脾臟指數(shù)法測(cè)定細(xì)菌毒力，測(cè)定各組疫苗株在小鼠脾臟中的定居能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)M5≥S19>S2≥RB51；待疫苗株在小鼠體內(nèi)清除后，腹腔內(nèi)接種布魯氏菌強(qiáng)毒株2308以1×105CFU只進(jìn)行攻毒檢測(cè)保護(hù)力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)M5的保護(hù)效果最好；分別分離免疫后第1-10周血清，ELISA檢測(cè)血清中IgG滴度及細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)水平，檢測(cè)各個(gè)疫苗株的抗體隨時(shí)間的免疫消長(zhǎng)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IgG水平S2、M5組總體高于其他組，而各

5、組IFN-γ水平總體上差異不顯著（P>0.05）；虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)和標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(yàn)(SAT)檢測(cè)血清凝集狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S2組、S19組抗體持續(xù)時(shí)間較其他組長(zhǎng)；同時(shí)無(wú)菌采取免疫不同布魯氏菌疫苗株脾臟、肝臟、腎臟等組織做病理切片觀察病理學(xué)變化差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)M5組的病變較其他組最強(qiáng)。⑵布魯氏菌RB51弱毒株和2308菌株LPS相關(guān)毒力基因差異。粗糙型布魯氏菌RB51疫苗弱毒株是光滑型牛種布魯氏菌2308株通過(guò)體外或體內(nèi)連續(xù)傳代培

6、養(yǎng)得到的變異菌株，但目前對(duì)RB51菌株確切的自然突變機(jī)制還尚不清楚，為了弄清毒力致弱的RB51株是否是由于O側(cè)鏈不合成的原因所致，或者合成LPS的某些基因受阻或缺失或突變所引起，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)以RB51和2308菌株為模板進(jìn)行PCR聚合酶鏈反應(yīng)，并對(duì)LPS主要的26個(gè)毒力基因進(jìn)行分子水平的測(cè)序分析。通過(guò)同源性分析比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于2308株，RB51在其基因組wboA基因中插入了序列大小為844bp的序列，但其他毒力基因分析比對(duì)同源性