水稻GUN4基因的克隆與功能分析.pdf

1、基因組解偶聯(lián)基因4(GENOMES UNCOUPLED4，GUN4)最先在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，不僅通過激活鎂螯合酶活性從而促進葉綠素合成，而且可能參與質體→核反向信號途徑的調控，但其具體機理尚不清楚。本研究中，我們以一個水稻葉綠素缺陷型的黃葉突變體黃玉B(HYB)為材料，利用圖位克隆，鑒定到一個GUN4的水稻同源基因OsGUN4，并確定該黃葉特征是由一個表觀遺傳突變等位基因epi-GUN4所控制。HYB的核苷酸序列與野生型親本的完全一致，但在

2、其啟動子中的一個抗氧化應答元件(antioxidant response element，ARE)的甲基化水平增加;去甲基化處理可部分恢復epi-GUN4的功能，使黃葉型幼苗回復正常綠色。在此基礎上，我們確定了OsGUN4的亞細胞定位，分析了OsGUN4對弱強光轉換和H2O2脅迫下的響應途徑。主要結果如下:
　　HYB具有光照強度敏感性。田間條件下，HYB在整個發(fā)育期內表現(xiàn)穩(wěn)定的黃葉表型，其葉綠素含量僅為野生型親本龍?zhí)仄諦(LTB

3、)的15.0％。該突變表型對環(huán)境條件敏感，特別是光照強度。在弱光條件下，HYB植株表現(xiàn)淡綠葉色，葉綠素含量約為LTB植株的33％;經強光下培養(yǎng)10天后，突變體葉色呈現(xiàn)黃色，其葉綠素含量僅為LTB植株的5％。
　　OsGUN4是HYB黃葉突變性狀的候選基因。為了揭示控制黃葉突變性狀的分子機理，采用圖位克隆法，利用來自于HYB和其他3個野生型(wild-type)品種雜交所構建的3173個F2黃葉隱性單株個體，在先前定位的基礎上，進一

4、步將該黃葉突變位點(xantha，XNT)定位于第11號染色體短臂上約57kb區(qū)間內，位于分子標記IDS7和SNP18之間。該區(qū)段共有8個預測的開放編碼閱讀框（openreading frames，ORFs），其中ORF2(Os11g1267000)預測編碼OsGUN4蛋白。但是，對定位區(qū)段的測序結果表明，HYB與LTB之間的核苷酸序列并無差異。為此，進一步對8個ORFs做了qRT-PCR表達分析。盡管ORF2在LTB植株葉片中高度表達

5、，但在HYB突變體植株中幾乎檢測不到OsGUN4轉錄物，而其他7個ORFs的表達則在LTB與HYB之間無顯著差異。
　　HYB的黃葉突變位點是OsGUN4基因的等位突變位點。為了證實可能是OsGUN4基因的突變導致了黃葉表型，將HYB與經伽瑪射線誘變處理的一個溫敏雄性不育水稻GS113的M2群體雜交，從約30000個M3F1穗行中選育得到4個出現(xiàn)黃葉幼苗的穗行。為了確定這些黃苗是否由OsGUN4基因突變引起，對該位點進行了測序，發(fā)

6、現(xiàn)黃葉幼苗存在3種缺失突變（其中2個穗行的突變一致），并定名為gun4-1～gun4-3。這些結果表明，HYB的黃葉突變是OsGUN4基因的等位突變位點。
　　黃葉突變是由OsGUN4的表觀遺傳突變引起。利用硫化測序法對HYB突變體中OsGUN4基因及其上下游序列進行了甲基化分析，發(fā)現(xiàn)OsGUN4的啟動子區(qū)域-2386 bp處有一個甲基化發(fā)生變化的位點，并且該位點恰好處于抗氧化應答元件(antioxidant response e

7、lement，ARE)上。利用去甲基化試劑5-氮嘧啶-2'雜（5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-dC）處理HYB及其黃葉衍生系會有28.0-56.0％的幼苗葉色恢復正常綠色，從而進一步確定了HYB的黃葉突變是一個OsGUN4的表觀遺傳等位突變，記為epi-GUN4。
　　OsGUN4的表達受ROS的間接誘導。OsGUN4基因僅含一個外顯子，cDNA全長1071 bp，編碼273個氨基酸，具有143個氨基酸（

8、第87-229個）組成的GUN4蛋白特有的類GUN4結構域。利用除草劑氟草敏(Norflurazon，NF)處理幼苗后，LTB中與光合作用活性相關的基因LHCB、PsaA的表達水平顯著降低，而HYB中LHCB、PsaA仍可維持較高的表達水平，表明epi-GUN4具有基因組解偶聯(lián)(Genomes Uncoupled，GUN)類基因所具有的典型特征，即其突變或下調表達并不會導致光合作用相關基因表達的下降。此外，H2O2和強光處理后，LTB中

9、OsGUN4的表達量均有顯著上升，而HYB中則保持不變，可見ARE元件是ROS誘導OsGUN4表達所必需的。放線菌酮(Cycloheximide，CHX)、放線菌酮和H2O2共處理LTB幼苗后，OsGUN4的相對表達量均遠遠低于H2O2單獨處理時的表達量，并且二者OsGUN4的表達具有類似的變化趨勢，表明OsGUN4的表達受ROS的間接誘導。利用亞細胞定位的方法確定了水稻GUN4蛋白是一個定位于葉綠體的蛋白。在恒光恒溫(16 h850μ

10、mol m-2 s-1/8 h暗培養(yǎng)，30℃)條件下，采用qRT-PCR方法分析表明，OsGUN4在粳稻品種日本晴和秈稻品種LTB中的表達具有光周期節(jié)律性。
　　OsGUN4突變會反饋影響許多核基因的表達。弱光下HYB植株合成的葉綠素幾乎與LTB相仿，表明水稻GUN4蛋白并非葉綠素合成所必需的，但其在ROS誘導的質體→核反向信號調控的抗氧化基因表達中可能起著重要作用。強光和H2O2的脅迫可激活Nrf2-ARE/Keap1抗氧化系統(tǒng)

11、的應答，而在HYB中該系統(tǒng)未被充分激活。我們也證實Nrf2和Keap1的表達受ROS的間接誘導。此外，還分析了OsGUN4突變對抗氧化基因表達影響，發(fā)現(xiàn)HYB突變體中NodL、OCT3、BAP1、OCT3、FER2和WRKY等基因的表達變化（下降）較大，TRFL4、APX1相對較小，而DREB2A則基本不變。為闡述OsGUN4在質體→核反向信號途徑中的作用，我們提出了一個初步的假說。
　　綜上所述，OsGUN4啟動子區(qū)域的ARE元

12、件不僅是OsGUN4正常表達所必需的，而且對于OsGUN4在氧化脅迫應答中發(fā)揮正常功能是重要的。水稻GUN4蛋白可能發(fā)揮多種功能，在強光脅迫下可能主要參與清除來自于O2分解而產生的ROS，而弱光下則促進葉綠素的合成。此外，HYB也是一個水稻中具有獨特特性的表觀遺傳突變體，主要表現(xiàn)為:(1) HYB中DNA甲基化位點恰好位于OsGUN4基因的啟動子區(qū)域ARE元件上，表明ARE元件的甲基化抑制了OsGUN4基因的表達;(2) HYB中，Os