水稻鹽敏感突變基因rss2的定位、克隆與功能分析.pdf

1、鹽害是限制農(nóng)作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要環(huán)境因素之一。水稻對(duì)鹽脅迫較為敏感，特別是在幼苗期和生殖期。為了闡明水稻耐鹽的遺傳機(jī)制，遺傳學(xué)家已經(jīng)定位了許多與水稻耐鹽性相關(guān)的QTL，但是其中大多數(shù)QTL的表型貢獻(xiàn)率較低，目前僅有少數(shù)耐鹽性相關(guān)QTL被克隆。篩選耐鹽或鹽敏感水稻突變體，定位克隆耐鹽相關(guān)基因已經(jīng)成為挖掘水稻耐鹽新基因的有效策略。
　　本研究從EMS誘變的水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica)突變體庫(kù)中篩

2、選鑒定到1份鹽敏感突變體，命名為rss2（rice salt sensitive2）。我們對(duì)該突變體的耐鹽生理特性和遺傳方式進(jìn)行了分析，通過(guò)QTL定位和圖位克隆手段將該突變基因分離，并對(duì)基因表達(dá)特性和生理功能進(jìn)行了初步解析。
　　在水培條件下，用120mM NaCl對(duì)野生型日本晴和rss2突變體進(jìn)行鹽處理。結(jié)果顯示:在鹽脅迫下，幼苗期的rss2突變體耐鹽性顯著降低，表現(xiàn)出快速和嚴(yán)重的萎蔫癥狀，復(fù)水后的死亡率顯著高于野生型。生理分析

3、結(jié)果顯示:同日本晴相比，rss2突變體地上部Na+含量顯著升高約62％，且Na+含量的差異主要集中在葉片上;而兩者植株水平上K+含量沒(méi)有顯著差異。在土培條件下，用120mMNaCl溶液澆灌處于三個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期（20d、40d和抽穗期）的日本晴和rss2突變體，結(jié)果表明rss2突變體在這三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期都比野生型感鹽。用不同鹽組分(NaCl、Na2SO4、NaNO3、Na+、Cl-、KCl、K2SO4、KNO3)處理幼苗，結(jié)果顯示rss2突變

4、體不僅對(duì)Na+敏感，對(duì)K+和Cl-也敏感。用山梨醇、甘露醇和PEG6000對(duì)日本晴和rss2突變體進(jìn)行滲透脅迫，結(jié)果表明兩者沒(méi)有顯著差異。綜上，鹽脅迫下，rss2突變體鹽敏感性可能主要是由地上部Na+過(guò)量積累即離子毒害導(dǎo)致的。
　　遺傳分析表明:鹽脅迫下，rss2/日本晴F1地上部Na+含量與日本晴相同，rss2/日本晴F2群體中低Na+含量單株數(shù)與高Na+含量單株數(shù)的比例符合3∶1分離。由此推斷，rss2突變體地上部Na+含量過(guò)

5、高是由單個(gè)基因發(fā)生隱性突變導(dǎo)致的。為定位該基因，我們利用rss2/窄葉青8號(hào)(ZYQ8)F2群體構(gòu)建了飽和分子連鎖圖譜，通過(guò)復(fù)合區(qū)間作圖分析，在第1和6染色體上分別檢測(cè)到一個(gè)控制地上部Na+含量的QTL(qSNC-1和qSNC-6，這兩個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率分別為14.5％和53.3％,提高Na+含量的等位基因均來(lái)源于rss2。為了確定哪個(gè)QTL是本研究要尋找的突變基因位點(diǎn)，我們利用日本晴/ZYQ8 F2群體構(gòu)建了第1和6染色體的分子連鎖

6、圖譜，并對(duì)地上部Na+含量進(jìn)行了QTL分析，結(jié)果在第1染色體上與qSNC-1相同位置處檢測(cè)到一個(gè)QTL，而在第6染色體上未檢測(cè)到相關(guān)QTL，這表明qSNC-6是RSS2基因的候選位點(diǎn)。通過(guò)擴(kuò)大作圖群體和開發(fā)新的分子標(biāo)記，利用極端隱性個(gè)體法對(duì)qSNC-6進(jìn)行了精細(xì)定位，最終將該基因定位在InDel標(biāo)記IM21980和IM22006之間約26.6 kb的染色體區(qū)間?？寺∪毡厩绾蛂ss2突變體中該區(qū)段DNA序列，測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)G→A的點(diǎn)突變

7、，該突變堿基位于一個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(Os06g0554800)的外顯子上，導(dǎo)致一個(gè)甘氨酸到天冬氨酸的突變。
　　Os06g0554800(LOC-Os06g36090)屬于ABC家族的ABCG亞家族（PDR亞家族），統(tǒng)一命名是OsPDR12。該基因有三種轉(zhuǎn)錄本，其ORF分別為3501bp（RSS2.1）、3504 bp（RSS2.2）和4503bp（RSS2.3）。OsPDR12（RSS2）的堿基突變位點(diǎn)位于三種轉(zhuǎn)錄本的共有區(qū)

8、域內(nèi)。生物信息學(xué)分析表明:RSS2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變位點(diǎn)位于PDR亞家族保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)，且突變后使跨膜區(qū)轉(zhuǎn)變?yōu)榉强缒^(qū)。
　　通過(guò)對(duì)OsPDR12的tos17插入突變體ospdr12耐鹽性研究發(fā)現(xiàn):鹽脅迫下ospdr12突變體也具有鹽害癥狀。通過(guò)RSS2三種轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明只有轉(zhuǎn)入RSS2.3后，rss2突變體耐鹽表型和地上部Na+含量才能恢復(fù)到野生型日本晴水平;而過(guò)表達(dá)植物沒(méi)有顯現(xiàn)出更耐鹽的性狀。綜上，鹽脅迫下，rss2突變體地上部N

9、a+含量過(guò)高是由OsPDR12基因突變導(dǎo)致的，且只有RSS2.3才參與耐鹽的調(diào)控。因此，本研究重點(diǎn)對(duì)RSS2.3的表達(dá)特性和基因功能進(jìn)行了分析。
　　35S∷ RSS2.3.∷GFP融合基因在水稻和洋蔥中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明:RSS2.3在細(xì)胞質(zhì)膜上特異性地表達(dá)。RSS2.3-GFP融合基因在蛙卵中表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論。RT-PCR和RSS2.3啟動(dòng)子-GUS染色結(jié)果顯示:幼苗期時(shí)，日本晴中的RSS2.3在各個(gè)組織均有表達(dá)，其中

10、葉片中表達(dá)量較高;在地上部及地下部，RSS2.3表達(dá)均不受鹽誘導(dǎo);RSS2.3特異性地在維管束韌皮部中表達(dá)。
　　分別測(cè)定了鹽脅迫下日本晴和rss2突變體韌皮部液和木質(zhì)部液中Na+含量，結(jié)果表明:二者韌皮部液中的Na+含量沒(méi)有顯著差異，而rss2突變體本質(zhì)部液的Na+含量極顯著地高于日本晴。由此可見，鹽脅迫下rss2突變體地上部Na+過(guò)高可能主要是由于rss2突變體通過(guò)木質(zhì)部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)Na+增多引起的，過(guò)量的Na+集中在葉片中，

11、產(chǎn)生離子毒害，從而導(dǎo)致rss2突變體的感鹽表型。RSS2.3在酵母（Na+敏感突變酵母菌株G19、K+吸收缺陷性酵母菌株CY162和GEF1缺失酵母菌株gel1）中的功能分析和利用雙電極電壓鉗分別記錄RSS2.3在Na+、K+和Cl-浴液中的電流，實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)RSS2.3具有轉(zhuǎn)運(yùn)Na+、K+和Cl-的功能。
　　本研究通過(guò)圖位克隆方法分離到一個(gè)新的水稻耐鹽相關(guān)基因OsPDR12，該基因最長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本RSS2.3定位于細(xì)胞質(zhì)膜，主要在