CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的研究與應(yīng)用.pdf

1、本實驗室已研制出的流感病毒、肝炎病毒中和抗體具有臨床應(yīng)用潛力，需要大量的抗體用臨床前研究。此外，診斷試劑盒與疫苗相關(guān)研究也需要大量具有天然構(gòu)象與活性的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，需要一個高效、經(jīng)濟的哺乳動物表達(dá)平臺。課題組前期已建立基于CHO-S與HEK293等細(xì)胞的瞬時基因表達(dá)平臺，表達(dá)量分別為15mg/L與80mg/L，課題組還引進(jìn)了CHO系列中的FIp-In及DHFR-缺陷系統(tǒng)等穩(wěn)定基因表達(dá)系統(tǒng)，為外源蛋白高表達(dá)提供了條件。
　　但在表達(dá)

2、過程中，培養(yǎng)基幾乎占據(jù)了表達(dá)成本的一半，大量表達(dá)時培養(yǎng)基耗費極大，此外商業(yè)培養(yǎng)基配方保密，如果存在干擾轉(zhuǎn)染或后續(xù)純化的物質(zhì)，無法排除，會使工藝變得極為復(fù)雜。為解決培養(yǎng)基的問題，本研究首先通過選擇合適的評價體系，確立了各類營養(yǎng)混合液的配制方法與添加閾值，結(jié)合文獻(xiàn)、專利報道的添加范圍與其它無血清培養(yǎng)添加因子，通過相互組合形成基礎(chǔ)培養(yǎng)基庫，篩選獲得L1，M1兩種最有潛力的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。通過配方分析，設(shè)計了L1與M1的混合測試，培養(yǎng)效果得到極大提

3、高，最高活細(xì)胞密度提高3倍，培養(yǎng)周期延長到6天以上。
　　本研究還發(fā)現(xiàn)，PVA可以減少細(xì)胞因為剪切力傷害造成的細(xì)胞破碎，還具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果，結(jié)合硫酸葡聚糖以及微量元素混合液的使用，細(xì)胞在含PVA的培養(yǎng)基中不會相互聚集成團或貼附在瓶壁上，生長狀態(tài)得到極大改善。本研究還對培養(yǎng)基的配制順序進(jìn)行分析與測試，確定最佳配制順序后通過調(diào)節(jié)NaCl的含量最終獲得了最優(yōu)培養(yǎng)基L1/M1，在后期培養(yǎng)、表達(dá)驗證中，該培養(yǎng)基適用于細(xì)胞傳代培養(yǎng)、凍存

4、以及復(fù)蘇。通過去除TFR以及在L1基礎(chǔ)上添加BSA與Yeast extract還獲得了能夠較好支持細(xì)胞培養(yǎng)的L1/M1-TFR與L1YB培養(yǎng)基，以上三種培養(yǎng)基的成本相較于商業(yè)培養(yǎng)基降低三分之二以上，為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)提供便利。
　　本研究通過配方分組測試，迅速排除了干擾轉(zhuǎn)染的物質(zhì)，使用L1/M1表達(dá)多種抗體和蛋白，表達(dá)量優(yōu)于商業(yè)培養(yǎng)基，產(chǎn)物活性一致。其中10F7cAb的表達(dá)量達(dá)到119.8mg/L，比商業(yè)培養(yǎng)基提高87.2％，通