HMGB1-A box對SW480和THP-1細胞LPS-TLR4信號通路的影響.pdf

1、目的:
　　觀察HMGB1-A box高表達對腸上皮細胞株SW480和單核細胞株THP-1中LPS/TLR4的影響,為以HMGB1-A box為靶點治療IBD提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法:
　　㈠ LPS對SW480細胞HMGB1表達的影響
　　實驗分組如下:
　?、賹φ战M:SW480+0ng/ml LPS;
　　②實驗組1:SW480+100ng/ml LPS;
　?、蹖嶒灲M2:SW480+

2、1000ng/ml LPS;
　?、軐嶒灲M3:SW480+10000ng/ml LPS;
　　培養(yǎng)SW480細胞至對數(shù)生長期,給予不同濃度LPS分別作用12h、24h收集細胞檢測HMGB1的表達(重復3次)。
　?、鏄嫿ê丸b定HMGB1-A box高表達細胞株
　?、臜MGB1-A box重組真核質(zhì)粒的構建及鑒定
　　①在GeneBank中查找人HMGB1-A box基因序列,由公司基因合成。
　　②

3、將合成的HMGB1-A box基因插入到pEGFP-N1載體,構建重組質(zhì)粒。擴增及提取重組質(zhì)粒,鑒定方法采用酶切和測序。
　?、艸MGB1-A box重組真核質(zhì)粒在SW480細胞內(nèi)的表達
　　采用陽脂質(zhì)體轉染技術將pEGFP-N1-HMGB1-A box轉染SW480細胞,分別觀察有無綠色熒光及熒光強度,并收集細胞檢測HMGB1-A box mRNA表達水平(重復3次)。
　　㈢HMGB1-A box高表達和EP對SW

4、480腸上皮細胞HMGB1、LPS/TLR4信號通路及促炎因子的影響
　　實驗分組:
　?、賹φ战M:SW480細胞;
　　②EP組:SW480細胞+EP;
　?、劭召|(zhì)粒組:轉染空質(zhì)粒的SW480細胞;
　?、蹵 box質(zhì)粒組:轉染HMGB1-A box質(zhì)粒的SW480細胞
　　上述各組再分為LPS及無LPS處理。( EP為5mM,預處理1h,LPS為1000ng/ml,24h),24h后收集細胞培養(yǎng)上

5、清及細胞(重復3次)。
　?、鐴P及HMGB1-A box高表達SW480細胞與THP-1細胞共培養(yǎng)對THP-1細胞HMGB1、LPS/TLR4信號通路及促炎因子分泌的影響
　　用Transwell系統(tǒng)將SW480細胞和THP-1細胞共培養(yǎng),實驗分組:
　?、賹φ战M:SW480細胞+THP-1;
　?、贓P組:SW480細胞+EP+THP-1;
　　③空質(zhì)粒組:轉染空質(zhì)粒的SW480細胞+THP-1;

6、>　　④A box質(zhì)粒組:轉染HMGB1-A box質(zhì)粒的SW480細胞+THP-1
　　上述各組再分為LPS處理及無LPS處理。( EP為5mM,預處理1h,LPS為1000ng/ml,24h),24h后收集細胞培養(yǎng)上清及細胞(重復3次)。
　　㈤檢測方法:
　?、賹崟r熒光定量PCR方法檢測細胞HMGB1、TLR4、MyD88 mRNA表達。
　　②免疫印跡方法檢測細胞HMGB1、TLR4、MyD88、pNF-

7、κB p65蛋白表達。
　　③雙抗夾心ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清中HMGB1含量。
　?、芄滔喽嘀仉p抗夾心ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。
　　結果:
　?、錖PS對SW480細胞內(nèi)HMGB1的影響:
　　①不同濃度的LPS處理SW480細胞12h,SW480細胞HMGB1 mRNA表達都有升高,其中LPS濃度為100ng/ml組與對照組相比,有統(tǒng)計學差異(P<0

8、.05);不同濃度LPS處理24h時,SW480細胞HMGB1 mRNA表達都有升高,其中1000ng/ml組HMGB1 mRNA表達與對照組相比,有統(tǒng)計學差異(P<0.01),而其它組間HMGB1 mRNA表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　②LPS處理SW480細胞不同時間,24h組HMGB1 mRNA表達均高于12h組,但只有1000ng/ml組有統(tǒng)計學意義(P<0.05),故本實驗選用LPS的處理時間為24h,作用濃度

9、為1000ng/ml。
　　㈡構建和鑒定HMGB1-A box高表達SW480細胞
　?、臜MGB1-A box重組真核表達質(zhì)粒的構建及鑒定
　　成功構建pEGFP-N1-HMGB1-A box重組表達質(zhì)粒,酶切后瓊脂糖凝膠電泳顯示兩條帶,其分子量大小與預期大小相同。測序分析顯示插入片段與PubMed基因文庫(GenBank Accession:NM_002128.4)中的HMGB1-A box基因序列相似性為100％

10、。
　　⑵HMGB1-A box重組真核質(zhì)粒在SW480細胞內(nèi)的表達
　　HMGB1-A box重組質(zhì)粒轉染SW480細胞后,在熒光顯微鏡下出現(xiàn)綠色熒光。細胞內(nèi)HMGB1-A box mRNA表達高于未轉染組(P<0.01),提示轉染成功。
　?、鏓P和HMGB1-A box高表達對SW480細胞HMGB1、LPS/TLR4信號通路及促炎因子分泌的影響
　?、鸥鹘M細胞內(nèi)HMGB1 mRNA及蛋白表達:
　　

11、HMGB1 mRNA和蛋白的表達在無LPS處理組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05),在LPS處理組EP組顯著低于對照組、空質(zhì)粒組和A box轉染組(P<0.05),后3組之間無統(tǒng)計差異(P>0.05);除EP組,各LPS處理均顯著高于相對應的無LPS處理組(P<0.05,0.01)。
　?、聘鹘M細胞內(nèi)TLR4 mRNA及蛋白的表達:
　　TLR4 mRNA和蛋白的表達在無LPS處理組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05),在LPS處

12、理組EP組顯著低于對照組、空質(zhì)粒組和A box轉染組(P<0.05),后3組之間無統(tǒng)計差異(P>0.05);除EP組,各LPS處理均顯著高于相對應的無LPS處理組(P<0.05,0.01)。
　?、歉鹘M細胞內(nèi)MyD88蛋白的表達:
　　MyD88 mRNA和蛋白的表達在無LPS處理組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05),在LPS處理組EP組顯著低于對照組、空質(zhì)粒組和A box轉染組(P<0.05),后3組之間無統(tǒng)計差異(P>0.

13、05);除EP組,各LPS處理均顯著高于相對應的無LPS處理組(P<0.05,0.01)。
　?、雀鹘M細胞內(nèi)pNF-κB p65蛋白的表達:
　　pNF-κBp65蛋白的表達在無LPS處理組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05),在LPS處理組EP組顯著低于對照組、空質(zhì)粒組和A box轉染組(P<0.05),后3組之間無統(tǒng)計差異(P>0.05);除EP組,各LPS處理均顯著高于相對應的無LPS處理組(P<0.05,0.01)。

14、r>　?、筛鹘M細胞培養(yǎng)上清中HMGB1、IL-1β、TNF-α和IL-6的含量:
　?、貶MGB1的含量在無LPS處理組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05),在LPS處理組EP組顯著低于對照組、空質(zhì)粒組和A box轉染組(P<0.05),后3組之間無統(tǒng)計差異(P>0.05);除EP組,各LPS處理均顯著高于相對應的無LPS處理組(P<0.01)。
　?、贗L-1β、TNF-α和IL-6的含量在無LPS處理組之間無統(tǒng)計學差異(P>

15、0.05),在LPS處理組EP組顯著低于對照組、空質(zhì)粒組和A box轉染組(P<0.05,0.01),后3組之間無統(tǒng)計差異(P>0.05);除EP組,各LPS處理均顯著高于相對應的無LPS處理組(P<0.05,0.01)。
　　㈣EP及HMGB1-A box高表達SW480細胞與THP-1細胞共培養(yǎng)對THP-1細胞HMGB1、LPS/TLR4信號通路及促炎因子分泌的影響
　?、鸥鹘M細胞內(nèi)HMGB1 mRNA及蛋白表達:

16、>　　THP-1細胞與SW480細胞共培養(yǎng)后,THP-1細胞中HMGB1 mRNA和蛋白的表達在無LPS處理組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05);在LPS處理組HMGB1 mRNA表達在EP組顯著低于對照組和空質(zhì)粒組(P<0.05),A box轉染組顯著低于空質(zhì)粒組(P<0.05),HMGB1蛋白表達在EP組和A box轉染組顯著低于對照組和空質(zhì)粒組(P<0.05);除EP組和A box轉染組,各LPS處理均顯著高于相對應的無LPS處理組

17、(P<0.05,0.01)。
　　⑵各組細胞內(nèi)TLR4 mRNA及蛋白的表達:
　　THP-1細胞與SW480細胞共培養(yǎng)后,THP-1細胞中TLR4 mRNA和蛋白的表達在無LPS處理組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05);在LPS處理組TLR4 mRNA表達在EP組和A box轉染組顯著低于對照組和和空質(zhì)粒組(P<0.05),TLR4蛋白表達在EP組顯著低于對照組和空質(zhì)粒組(P<0.01),A box轉染組顯著低于空質(zhì)粒組(P

18、<0.05);除EP組和A box轉染組各LPS處理均顯著高于相對應的無LPS處理組(P<0.05,0.01)
　?、歉鹘M細胞內(nèi)MyD88 mRNA及蛋白的表達:
　　THP-1細胞與SW480細胞共培養(yǎng)后,THP-1細胞中MyD88 mRNA和蛋白的表達在無LPS處理組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05);在LPS處理組MyD88 mRNA和蛋白表達在 EP組和 A box轉染組顯著低于對照組和空質(zhì)粒組(P<0.05);除EP

19、組和A box轉染組各LPS處理均顯著高于相對應的無LPS處理組(P<0.05,0.01)。
　?、雀鹘M細胞內(nèi)pNF-κB p65蛋白的表達:
　　THP-1細胞與SW480細胞共培養(yǎng)后,THP-1細胞中pNF-κBp65蛋白表達在無LPS處理組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05);在LPS處理組pNF-κBp65蛋白表達在EP組和A box轉染組顯著低于對照組(P<0.01);A box轉染組顯著低于空質(zhì)粒組(P<0.01),

20、除EP組和A box轉染組各LPS處理均顯著高于相對應的無LPS處理組(P<0.05)。
　?、筛鹘M細胞培養(yǎng)上清中HMGB1、IL-1β、TNF-α和IL-6的含量:
　?、賂HP-1細胞與SW480細胞共培養(yǎng)后,培養(yǎng)上清中HMGB1含量在無LPS處理組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05);在LPS處理組HMGB1含量在EP組和A box轉染組顯著低于對照組和空質(zhì)粒組(P<<0.05,0.01);除EP組和A box轉染組各LP

21、S處理均顯著高于相對應的無LPS處理組(P<0.01)。
　?、赥HP-1細胞與SW480細胞共培養(yǎng)后,培養(yǎng)上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量在無LPS處理組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05);在LPS處理組它們的含量在EP組和A box轉染組顯著低于對照組和和空質(zhì)粒組(P<0.01);除EP組和A box轉染組各LPS處理均顯著高于相對應的無LPS處理組(P>0.05,P<0.01)。
　　結論:
　　1、L