問號鉤端螺旋體LA0202基因的鑒定與功能研究.pdf

1、問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株＃56601(強毒株)的全基因組測序工作已經(jīng)完成。在基因詮釋的基礎(chǔ)上, 國內(nèi)外學(xué)者相繼鑒定出在問號鉤端螺旋體賴株染色體上有眾多溶血素編碼基因，并認(rèn)為溶血素可能和鉤端螺旋體致病相關(guān)。LA0202基因是位于問號鉤端螺旋體賴株大染色體上類噬菌體片段上的一個基因，運用生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)及二級結(jié)構(gòu)和大腸埃希菌K12株成孔蛋白類溶血素E（ Hemolysin E)及化膿性鏈球菌MGAS315株中

2、推測的孔形成多肽具有一定的相似性，推測其可能又是一個和鉤端螺旋體致病相關(guān)的溶血素基因。因此，本實驗主要對LA0202基因進行鑒定，并對其功能性進行分析，為進一步探究問號鉤端螺旋體的致病機制奠定基礎(chǔ)。 首先將LA0202基因克隆到pET28b(+)原核表達載體中并成功在體外表達純化了該蛋白。 RT-PCR和Western-blot實驗證明LA0202基因在問號鉤端螺旋體賴株中可以轉(zhuǎn)錄和表達。然后對此表達的蛋白進行了體外溶血活性、溶

3、血機制及細(xì)胞毒性等一系列實驗研究。 結(jié)果如下：（1）溶血活性實驗顯示：LA0202 蛋白具有溶血活性：通過血平板熱-冷孵育法觀察到清晰的β-溶血環(huán)；通過透射電鏡觀察法看到溶血素作用后的綿羊紅細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)染色不均一，細(xì)胞內(nèi)部有空泡出現(xiàn)，細(xì)胞膜不完整，局部已出現(xiàn)破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物開始外泄。（2）溶血機制研究表明：不同濃度的滲透壓保護劑PEG加入后對溶血素LA0202的溶血活性均有明顯抑制作用；經(jīng)加熱處理后溶血素LA0202的溶血活性

4、完全喪失；金屬陽離子Mg2+﹑Mn2+﹑Ca2+，蛋白酶抑制劑EDTA和PMSF對溶血素的溶血活性影響不大，因此初步推測LA0202為成孔蛋白類溶血素。（3）細(xì)胞毒性研究表明：LA0202蛋白對肝細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用，通過倒置顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測顯示，溶血素LA0202作用正常人肝細(xì)胞L-02后呈現(xiàn)出顯著細(xì)胞毒性，肝細(xì)胞不僅顯現(xiàn)細(xì)胞壞死特征而且還同時顯現(xiàn)細(xì)胞凋亡特征，并且肝細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例隨著溶血素作用