弓形蟲半巢式PCR檢測方法的建立及弓形蟲P30基因的表達(dá).pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)呈全球性分布,專性細(xì)胞內(nèi)寄生,能導(dǎo)致人獸共患的弓形蟲病。通常成人感染弓形蟲多無癥狀,但孕婦、嬰兒和免疫低下者感染后危害極大。牲畜感染弓形蟲也給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。迄今為止,弓形蟲的診斷主要依靠病原學(xué)檢測和血清學(xué)檢測,且對該病的預(yù)防仍無理想的方法。本研究旨在建立弓形蟲半巢式PCR檢測體系,并對編碼弓形蟲主要表膜蛋白的P30基因進行了原核表達(dá),同時構(gòu)建P30基因的真核表達(dá)載體,為進一步研

2、究以減毒沙門氏菌為載體的基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 弓形蟲經(jīng)小鼠腹腔傳代后,取腹水,提取DNA,加入NTE后置-20℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)GeneBank上公布的弓形蟲RH株的P30基因(X14080)設(shè)計了三條特異性引物P1、P2和P3,經(jīng)PCR擴增及條件優(yōu)化,該體系擴增出約250bp的目的片段。以外引物P1和P3擴增出約500bp的片段,將該擴增產(chǎn)物克隆到pUCm-T載體上進行測序。測序結(jié)果表明,該擴增片段與P30基因(X14080

3、)的序列同源性為99.8％。該PCR檢測體系不能在健康豬血液、豬鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌和豬圓環(huán)病毒DNA上擴增出條帶;其最低檢測的DNA含量為0.45pg,表明該檢測體系具有較好的特異性和敏感性。
　　 弓形蟲速殖子的主要表膜蛋白P30能夠刺激機體產(chǎn)生許多細(xì)胞因子和抵抗弓形蟲感染的抗體。根據(jù)P30基因(X14080)再設(shè)計一對引物,在上下游引物分別加上酶切位點EcoRI和XhoI,以便于插入載體中。經(jīng)PCR擴增

4、后,回收該條帶,將該PCR擴增片段連入pUCm-T載體中,構(gòu)建pUCm-P30載體,并轉(zhuǎn)化入Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。pUCm-P30載體經(jīng)EcoR I和Xho I切后,回收酶切后的P30片段,與同樣經(jīng)過酶切回收的pET-30(a)片段相連,構(gòu)建pET-P30載體,轉(zhuǎn)入BL21菌株中。測序后與參考序列(X14080)比較,核苷酸同源性為99.9％。取陽性菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳顯示表達(dá)的重組蛋白的分子量在25.

5、0-35.0kDa之間;而且Westen-blot顯示,純化后的表達(dá)產(chǎn)物被鼠抗弓形蟲陽性血清所識別。
　　 pET-P30載體經(jīng)EcoR I和Xho I酶征切后,回收酶切后的P30片段,與同樣經(jīng)過酶切回收的pcDNA3片段相連,構(gòu)建pcDNA3-P30載體,轉(zhuǎn)化入Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,測序后與參考序列(X14080)比較,核苷酸同源性為99.9％。將鑒定陽性質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌中,成功構(gòu)建以減毒沙門氏菌為載體的基因