海豚鏈球菌CAMP因子原核表達(dá)及生物學(xué)特性研究.pdf

1、本研究以斑點(diǎn)叉尾鮰源海豚鏈球菌（Streptococcus iniae，S.iniae）廣西分離株DGX07為實(shí)驗(yàn)菌株提取總DNA作為模板，對(duì)CAMP因子基因進(jìn)行PCR(Polymerase Chain Reaction)擴(kuò)增;將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMD19-T質(zhì)粒中進(jìn)行測(cè)序，并應(yīng)用不同的生物信息學(xué)軟件對(duì)其核酸及氨基酸序列進(jìn)行分析;將含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的csi基因連接至pMD19-T質(zhì)粒中，酶切回收后將其連接至表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)上

2、，最終轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）原核表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)大腸桿菌內(nèi);將陽性表達(dá)菌株進(jìn)行CAMP因子重組誘導(dǎo)表達(dá)，并優(yōu)化表達(dá)條件;用重組CAMP因子蛋白免疫新西蘭大白兔，并進(jìn)行Western-blot以檢驗(yàn)該蛋白的免疫原性以及在海豚鏈球菌中的表達(dá)情況;用Western-blot檢驗(yàn)重組CAMP因子對(duì)IgG非特異性的粘附;用CAMP因子抗血清探究其對(duì)海豚鏈球菌對(duì)鯉魚上皮瘤細(xì)胞（Epitheliom

3、a papulosum cyprini，EPC）粘附及侵染的抑制水平;用重組CAMP因子與重組金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）鞘磷脂酶(sphingomyelinase)探究其對(duì)不同物種血細(xì)胞的促溶血特性。
　　核酸及蛋白質(zhì)序列分析表明，海豚鏈球菌CAMP因子隸屬于CAMP因子超家族，并與其他鏈球菌CAMP因子同源，但是其與親緣關(guān)系最近的犬鏈球菌（Streptococcus canis）的相似度僅為63

4、％，且該蛋白質(zhì)含有60.1％的可變氨基酸，這表明海豚鏈球菌CAMP因子不屬于保守蛋白質(zhì);NCBI在線預(yù)測(cè)軟件分析表明，CAMP因子含有信號(hào)肽序列，1個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)，以及16個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn);SDS-PAGE顯示，海豚鏈球菌重組CAMP因子的蛋白大小為48kDa，且大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)在IPTG濃度為0.8mmol/L、37℃下誘導(dǎo)表達(dá)5h時(shí)，表達(dá)水平達(dá)到最大;瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CAMP因子抗血清效價(jià)為1∶32;Western-

5、blot結(jié)果顯示，重組CAMP因子具有抗原性，且海豚鏈球菌存在CAMP因子的表達(dá);細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，被CAMP因子抗血清中和了的海豚鏈球菌顯示出粘附以及入侵鯉魚上皮瘤細(xì)胞能力減弱的現(xiàn)象，其中粘附水平下降至58.4％，而侵入水平下降更多，至42.7％，這表明CAMP因子在海豚鏈球菌侵入機(jī)體后粘附并進(jìn)入上皮細(xì)胞中起著較為重要的作用;Western-blot結(jié)果顯示，a-烯醇化酶抗血清與CAMP因子預(yù)孵育后，其與α-烯醇化酶結(jié)合的能力出現(xiàn)下降，這表