mTOR-p70S6K信號(hào)通路在小兒血管瘤演變中的作用.pdf

1、目的：探討mTOR/p70S6K信號(hào)通路在小兒血管瘤的發(fā)生、發(fā)展及消退過(guò)程中的作用。
　　 方法：
　　 1.收集遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2005年-2009年未經(jīng)其他治療、單純行手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷為血管瘤的標(biāo)本31例，結(jié)合Mulliken分類(lèi)法與增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)對(duì)血管瘤進(jìn)行分類(lèi)和分期，免疫組化檢測(cè)并比較增生期血管瘤和消退期血管瘤組織中mTOR、p70S6K-α的表達(dá)水平。
　　 2.用組織塊法培養(yǎng)血管

2、瘤內(nèi)皮細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層細(xì)胞以后傳代，建立血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞系，觀察其增殖特征，并用第Ⅷ凝血因子相關(guān)抗原進(jìn)行鑒定。同步化培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，采用Western blot法檢測(cè)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞mTOR、p70S6K-α的表達(dá)水平，同期用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞周期的變化；并分析mTOR、p70S6K-α的表達(dá)水平與血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞周期的分布及細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。
　　 3.待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，換無(wú)血清培養(yǎng)液孵育48h使細(xì)胞同

3、步化，然后分別加入O，雷帕霉素10nmol/L，繼續(xù)孵育24h，細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，檢測(cè)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞mTOR、p70S6K-α的表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞周期的分布。
　　 結(jié)果：
　　 1.18例增殖期血管瘤mTOR、p70S6K-α的積分光密度分別為6336.48±1655.89，588.72±223.87；13例消退期血管瘤mTOR、p70S6K-α的積分光密度分別為846.22±297.09，3235.

4、64±947.77；血管瘤增殖期p70S6K-α的積分光密度明顯低于消退期，差異有顯著性（P<0.01）；血管瘤增殖期mTOR.的積分光密度明顯高于消退期，差異有顯著性（P<0.01）。
　　 2.培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞于4天后開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，一周后只有少量細(xì)胞鋪展貼壁生長(zhǎng)，兩周后開(kāi)始生長(zhǎng)分裂，三周后細(xì)胞殲始快速生長(zhǎng)，四周后細(xì)胞鋪滿板底。用相差倒置顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)所分離的內(nèi)皮細(xì)胞呈上皮細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)細(xì)胞第Ⅷ凝血因子相關(guān)抗原表達(dá)為陽(yáng)性

5、。
　　 3.mTOR蛋白表達(dá)水平較高，p70S6K-α蛋白表達(dá)水平較低時(shí)，處于G0/G1期的細(xì)胞較少（55.95±4.38）％；mTOR蛋白表達(dá)水平下降，p70S6K-α蛋白表達(dá)水平升高，處于Go/G1期的細(xì)胞明顯增多（77.86±8.18）％。
　　 4.雷帕霉素作用于體外培養(yǎng)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞周期變阻滯在G1期，雷帕霉素作用前后差異具有顯著性（P<0.01）；mTOR蛋白表達(dá)水平下降（P<0.01）

6、；p70S6K-α蛋白表達(dá)水平升高（P<0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 1.在血管瘤增生期mTOR高表達(dá)可能導(dǎo)致p70S6K-α的活化磷酸化，促進(jìn)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞由G0/G1進(jìn)入S期，血管瘤呈快速增殖狀態(tài)。而在血管瘤消退期，在某種機(jī)制作用下，mTOR表達(dá)減少，抑制了p70S6K-α的磷酸化，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，進(jìn)而促進(jìn)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，血管瘤表現(xiàn)出自然消退的趨向。
　　 2.體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)