高表達(dá)重組TCS對(duì)人宮頸癌Caski細(xì)胞p73基因甲基化影響的機(jī)制研究.pdf

1、目的:觀察高表達(dá) rTCS對(duì)宮頸癌 Caski細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期,及甲基化轉(zhuǎn)移酶I(DNA methyltransferase,DNMT1)的表達(dá)和抑癌基因 p73啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的影響。探索高表達(dá) rTCS是否能抑制Caski細(xì)胞生長,是否具有去甲基化作用,能否誘導(dǎo) p73基因重新表達(dá),從而為 rTCS抗宮頸癌藥效及機(jī)制研究提供理論依據(jù)。
　　方法:(1)限制性內(nèi)切酶酶切、瓊脂糖凝膠電泳切膠回收、T4連接酶連接等方法構(gòu)建真核表

2、達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)/6xHis-TCS。(2)反轉(zhuǎn)錄 PCR(RT-PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR(FQ-PCR)、蛋白免疫印記(Western-blot)篩選高表達(dá) rTCS的Caski細(xì)胞株,及檢測(cè) DNMT1和p73的表達(dá)情況。(3)MTT還原測(cè)定法比較分析細(xì)胞生長情況。(4) FCM用于分析細(xì)胞周期變化。(5)甲基化特異性 PCR(methylation-specific PCR, MSP)法檢測(cè) p73基因5ˊ端啟動(dòng)子區(qū)

3、 CpG島甲基化狀態(tài)的改變。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建 rTCS真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)/6xHis-TCS,將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Caski細(xì)胞株,經(jīng) G418篩選,RT-PCR和Western-blot鑒定,獲得高表達(dá) rTCS的Caski細(xì)胞株。(2)高表達(dá) rTCS的Caski細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)增殖速度明顯低于對(duì)照組,二者在24h、48h、72h均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01);FCM結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞 G1期和G

4、2期細(xì)胞數(shù)比例高于對(duì)照組(p<0.5),而S期較對(duì)照組低(p<0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞 DNMT1在 mRNA及蛋白水平的表達(dá)均低于對(duì)照組,其中mRNA水平降低0.56倍(p<0.01)。(4)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞 p73基因啟動(dòng)子甲基化程度比對(duì)照組細(xì)胞有所降低,而p73mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照細(xì)胞。
　　結(jié)論:(1)rTCS高表達(dá)能夠顯著抑制Caski細(xì)胞增殖并能將細(xì)胞抑制在 G1和G2期,且隨時(shí)間延長,抑制程度增