高表達(dá)精脒合成酶抑制人宮頸癌Caski細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移.pdf

1、　　目的：研究精脒合成酶(spermidine synthase, SPDS)高表達(dá)對(duì)人宮頸癌Caski細(xì)胞的多胺含量,細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞遷移的影響。
　　方法：采用巢氏PCR法從人宮頸癌Caski細(xì)胞cDNA中克隆出人基因SPDS并構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/SPDS。將pcDNA3.1(-)空載和pcDNA3.1(-)/SPDS質(zhì)粒用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞,然后用Western blot 和RT-PCR分別檢測(cè)成

2、功轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)SPDS的 mRNA和蛋白表達(dá)水平,由此篩選獲得對(duì)照細(xì)胞株Caski/3.1和精脒合成酶高表達(dá)細(xì)胞株Caski/SPDS。QT-RT-PCR用于檢測(cè)細(xì)胞中ODC(鳥(niǎo)氨酸脫羧酶)、OAZI(鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抗酶抑制因子)、AMDC(S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶)、SMS(精胺合成酶)、SSAT(精脒/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶)和 APAO(乙酰多胺氧化酶)的 mRNA水平。MTT 法和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)用于檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期。反相高效液相色

3、譜用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)多胺水平。Transwell技術(shù)用于分析細(xì)胞的遷移能力。Western blot用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Annexin A2的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1) 成功獲得高表達(dá)SPDS的Caski細(xì)胞克隆株Caski/SPDS。Caski/SPDS細(xì)胞中的SPDS在mRNA和蛋白水平的表達(dá)明顯高于Caski/3.1細(xì)胞。2) SPDS高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多胺合成酶ODC、AMDC和SMS,降解代謝酶SMO、SSAT和APAO mR

4、NA水平均顯著性升高,而對(duì)OAZI mRNA水平?jīng)]有影響。3) 高表達(dá)SPDS能抑制Caski細(xì)胞增殖并影響Caski細(xì)胞的細(xì)胞周期,G0/G1期細(xì)胞增加而S期細(xì)胞減少。4) 反相高效液相色譜結(jié)果顯示,Caski/SPDS細(xì)胞中腐胺的含量明顯減少,精脒和精胺的含量略微上升,多胺總含量顯著性下降。5) SPDS高表達(dá)可明顯抑制Caski細(xì)胞的遷移,并抑制細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白Annexin A2的表達(dá)。6) SPDS高表達(dá)降低Caski細(xì)胞對(duì)抗