14-3-3蛋白在阿爾茨海默病SET核運輸中的作用及其分子機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開論述：
　　第一部分 探討過表達14-3-3β/δ對SET核運輸障礙的影響及其潛在的分子機制，為AD藥物開發(fā)提供有效的分子靶點。
　　背景：PP2A活性下降導致 tau過度磷酸化，進而促進神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFTs)形成，是阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)。核蛋白SET是體內(nèi)PP2A特異、高效的抑制劑，主要分布在

2、嗅球、海馬、大腦皮質(zhì)、尾殼核、丘腦等腦區(qū)。AD患者經(jīng)免疫化學檢測發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)SET表達水平明顯增高，而且細胞定位也從細胞核轉(zhuǎn)至細胞漿，并且發(fā)現(xiàn)SET共定位于神經(jīng)元胞漿內(nèi)PP2A及過度磷酸化的tau蛋白。前期研究發(fā)現(xiàn)：過表達SET導致大鼠PP2A活性顯著降低，tau異常過度磷酸化，神經(jīng)元退變，甚至出現(xiàn)AD患者樣運動功能障礙的表現(xiàn)。上述研究結果說明：作為PP2A上游調(diào)節(jié)因子，SET在AD腦內(nèi)自核轉(zhuǎn)運并滯留于胞漿聚集是引起AD發(fā)病的一個非常關鍵的

3、因素。因此，明確AD腦內(nèi)SET核運輸?shù)木唧w機理將有助于詮釋AD的發(fā)病機制。然而SET如何轉(zhuǎn)運并聚積于胞漿內(nèi)，以及PP2A活性被SET所抑制的具體分子機制尚不清楚。前期針對SET核運輸相關的核定位信號(Nuclear localization signal,NLS)序列展開了相應研究，結果發(fā)現(xiàn)：Ser-9位點磷酸化失活SET核定位信號，造成核輸入蛋白不能正常結合SET，導致SET滯留胞漿。然而，AD患者腦內(nèi)SET Ser-9磷酸化的分子機

4、制及其它可能致SET滯留胞漿聚集的機制有待進一步明確。14-3-3蛋白作為接頭/支架蛋白與其他蛋白質(zhì)結合，廣泛參與了細胞凋亡、細胞分裂、信號轉(zhuǎn)導、蛋白跨膜轉(zhuǎn)運等重要生命活動的調(diào)節(jié)進程。近來更多的研究揭示了14-3-3蛋白在核運輸中的調(diào)控作用。比如Cdc25蛋白的Ser-216被磷酸化后可以與14-3-3ε結合形成Cdc25/14-3-3ε復合物，并導致Cdc25不能結合importinα正常進入到細胞核中，類似的還有RSG，HDAC4蛋

5、白等。這些研究均提示：14-3-3蛋白對于核-漿穿梭蛋白的核輸入具有負調(diào)作用。同時，14-3-3β/δ在AD患者腦內(nèi)過表達，存在于NTFs中，與AD患病進程正相關。這些研究提示：14-3-3β/δ蛋白參與了AD的病理過程，但具體機制不明。具有核輸入負調(diào)作用的14-3-3蛋白與其靶蛋白結合存在識別序列 RX1-2SX2-3S(X代表基本氨基酸)，通過篩選SET的全長，發(fā)現(xiàn)其146 NESGDPSSKST156序列，符合14-3-3蛋白識別

6、序列RX1-2SX2-3S，提示：14-3-3蛋白可能通過結合SET導致其滯留胞漿，抑制PP2A活性，參與AD發(fā)病。本研究證實：14-3-3通過與核輸入蛋白 importinα競爭性結合 SET，導致核輸入復合物形成障礙，SET入核困難而滯留胞漿，進而引起AD下游病理事件。
　　目的：探討過表達14-3-3β/δ對SET核運輸障礙的影響及其潛在的分子機制，為AD藥物開發(fā)提供有效的分子靶點。
　　方法：培養(yǎng)HEK293/tau

7、細胞，轉(zhuǎn)染表達14-3-3β/δ48 h后通過共聚焦/雙光子顯微鏡和WB檢測SET的亞細胞分布。通過Co-IP方法檢測過表達14-3-3β/δ組SET與14-3-3β/δ及核輸入蛋白Importinα的結合程度。通過篩選SET全長，發(fā)現(xiàn)其146 NESGDPSSKST156序列，符合14-3-3蛋白識別序列RX1-2SX2-3S，為此，合成具有穿膜和透血腦屏障功能的純化Tat肽段Tat-NESGDPSSKST(Peptide1)，和亂序

8、序列作為對照的Tat肽段Tat-NSSTEDGPKSS(Peptide2)。在HEK293/tau細胞轉(zhuǎn)染表達14-3-3δ的同時加入人工合成并純化Tat肽段，48h后通過共聚焦/雙光子顯微鏡和WB檢測SET的亞細胞分布。通過Co-IP方法檢測加入Peptide1/2組是否影響SET與14-3-3β/δ及核輸入蛋白Importinα的結合。通過PP2A活性檢測試劑盒(Promega, Cat.＃ V2460)測定過表達14-3-3β/δ

9、及Peptide1/2干預后對PP2A活性的影響。利用免疫印跡方法檢測過表達14-3-3β/δ，SET，14-3-3β/δ+SET后對tau蛋白Ser199，Ser202，Thr205，Thr231, Ser262，Ser396和 Ser404位點磷酸化程度的影響；人工包裝過表達14-3-3δ的腺相關病毒(Adeno-associated virus,AAV)，通過腺相關投遞系統(tǒng)感染C57小鼠，分別用Peptide1/2干預，進一步明確

10、SET與14-3-3蛋白的結合序列NESGDPSSKST，確定其可能成為促進SET入核的小分子肽，為AD有些藥物開發(fā)提供候選分子靶點。通過條件恐懼實驗，水迷宮實驗來檢測行為學的變化，激光共聚集熒光顯微鏡下觀察腦片上SET蛋白的亞細胞定位。64位陣列系統(tǒng)檢測活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化，體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元檢測神經(jīng)元樹突，樹突棘等的變化，免疫印跡實驗檢測小鼠海馬synaptotagmin， synaptophysin，

11、 synapsin1，phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)，NR1，NR2A和NR2B等突觸蛋白及SET Ser-9磷酸化的變化。
　　結果：在HEK293/tau細胞株中，分別過表達14-3-3β/δ導致大部分SET自核轉(zhuǎn)運并滯留于胞漿。分別分離提取胞漿及胞核蛋白后，發(fā)現(xiàn)過表達14-3-3β/δ組細胞核內(nèi)的SET蛋白量明顯減少，而在胞漿中明顯增加；通過免疫共沉淀方法檢測到過表達14-3-3β

12、/δ后SET與importinα結合減少導致SET核輸入障礙。還觀察到在轉(zhuǎn)染了14-3-3δ的HEK293/tau細胞株中，用Peptide1處理導致SET正常轉(zhuǎn)運到細胞核中。利用核蛋白提取試劑盒分離提取胞漿與胞核蛋白，發(fā)現(xiàn)核蛋白中Peptide1處理組的SET量明顯增高，而在胞漿蛋白中明顯減少；通過免疫共沉淀方法檢測到Peptide1處理組SET與importinα結合隨劑量逐漸增加。還觀察到過表達14-3-3β/δ后顯著抑制PP2A

13、活性，并導致tau蛋白在Ser199，Ser202，Thr205，Thr231，Ser262，Ser396和 Ser404位點發(fā)生過度磷酸化，Peptide1處理可恢復PP2A活性。進一步在小鼠海馬齒狀回(Dentategyrus，DG)定位注射AAV8-14-3-3δ病毒感染動物，并用Peptide1/2干預，發(fā)現(xiàn)過表達14-3-3δ后，小鼠情景恐懼實驗和水迷宮實驗均表現(xiàn)學習和記憶的障礙，而Peptide1處理可以有效恢復。激光共聚集

14、熒光顯微鏡下觀察到腦片中不同區(qū)域Peptide1可以恢復過表達14-3-3δ引起的SET胞漿滯留現(xiàn)象。64位陣列系統(tǒng)檢測活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化，發(fā)現(xiàn)過表達14-3-3δ可以顯著抑制LTP，而Peptide1處理可以有效恢復，體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)過表達14-3-3δ可導致神經(jīng)元樹突長度縮短，分支減少，樹突棘密度減少等變化，而Peptide1處理可以有效恢復，免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)在小鼠海馬蛋白中，過表達14-3

15、-3δ可導致synaptotagmin，synaptophysin， synapsin1，phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)等突觸前蛋白減少，NR2A：NR2B比值變大，SET Ser-9顯著磷酸化，Peptide1處理可以有效恢復上述變化。
　　結論：14-3-3β/δ可以通過與SET蛋白的NESGDPSSKST序列結合，導致SET與importinα結合顯著減少，從而引起SET核輸入障礙

16、，滯留胞漿，顯著抑制PP2A活性，并導致tau蛋白發(fā)生過度磷酸化，神經(jīng)元樹突損傷，LTP及學習和記憶的損傷。通過給予Tat-NESGDPSSKST肽段可以通過有效競爭性結合14-3-3β/δ來釋放SET，使SET核輸入正常而主要定位與胞核，減少對胞漿中PP2A的抑制，恢復PP2A活性，減少神經(jīng)元樹突損傷，恢復LTP及學習和記憶的損傷等。
　　第二部分 探討14-3-3δ與CKII介導SET滯留胞漿的分子機制，進一步闡明AD發(fā)病機制

17、。
　　背景：第一部分研究發(fā)現(xiàn)過表達14-3-3δ導致SET滯留在胞漿，并伴有SET Ser-9磷酸化現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn) SET上游蛋白激酶 CKII在AD腦內(nèi)上調(diào)，二聚體的14-3-3δ可募集CKII。為此設想：14-3-3δ在結合SET的同時，也俘獲CKII，從而使得SET更容易成為CKII的底物被磷酸化，進一步引起磷酸化SET與importinα結合障礙，導致SET滯留胞漿。
　　目的：探討14-3-3δ與CKII介導S

18、ET滯留胞漿的分子機制，進一步闡明AD發(fā)病機制。
　　方法：通過海馬DG區(qū)注射AAV8-14-3-3δ病毒，感染C57小鼠，激光共聚集熒光顯微鏡下觀察腦片SET的亞細胞定位，以及SET、14-3-3δ及CKIIα的分布與共定位。培養(yǎng)HEK293/tau細胞，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+/14-3-3δ48 h后，通過免疫共沉淀方法檢測SET、14-3-3δ及CKIIα的結合程度。使用CKII特異性抑制劑TBB（4,5,6,7-Tetra

19、bromobenzotriazole）處理轉(zhuǎn)染14-3-3δ的HEK293/tau細胞，檢測SET Ser-9磷酸化變化，SET表達量變化，CKIIα表達量變化。已轉(zhuǎn)染CKIIα的HEK293/tau細胞給予si14-3-3δ處理，檢測SET Ser-9磷酸化變化，SET表達量變化，CKIIα表達量變化。通過絲氨酸/蘇氨酸檢測試劑盒(Promega, Cat.＃ V2460)測定PP2A活性。人工包裝過表達CKIIα的AAV病毒感染C5

20、7小鼠，同時分別用AAV8-si14-3-3δ、AAV8-Ssi處理。通過條件恐懼實驗，水迷宮實驗來檢測行為學的變化，激光共聚集熒光顯微鏡下觀察腦片上SET蛋白的亞細胞定位。64位陣列系統(tǒng)檢測活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化，體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元檢測神經(jīng)元樹突，樹突棘等的變化，免疫印跡檢測小鼠海馬synaptotagmin，synaptophysin，synapsin1， phosphorylated synapsin1

21、(p-synapsin1)，NR1，NR2A和NR2B等突觸蛋白及SET Ser-9磷酸化的變化。
　　結果：過表達14-3-3δ的AAV8病毒感染C57小鼠腦片上，可以觀察到SET、CKIIα、14-3-3δ三者間可相互共定位，且過表達14-3-3δ動物腦內(nèi)SET主要定位于胞漿。在HEK293/tau細胞株中，免疫共沉淀結果顯示SET、CKIIα、14-3-3δ三者間相互結合，且過表達14-3-3δ組的結合程度顯著增強。這些結果

22、提示：14-3-3在結合SET的同時，也可募集CKIIα。已轉(zhuǎn)染14-3-3δ的HEK293/tau細胞給予CKII抑制劑TBB處理后發(fā)現(xiàn)，SET Ser-9磷酸化程度顯著降低；給予si14-3-3δ處理后發(fā)現(xiàn)，敲減14-3-3δ可導致SET Ser-9磷酸化程度降低。說明CKIIα通過14-3-3δ的募集促進對SET的磷酸化修飾。PP2A活性檢測發(fā)現(xiàn)TBB處理可很好的恢復由于14-3-3δ引起的PP2A活性降低。人工包裝過表達CKII

23、α的AAV8病毒感染C57小鼠，同時分別用AAV8-si14-3-3δ、AAV8-Ssi處理，條件恐懼、水迷宮實驗實驗發(fā)現(xiàn)si14-3-3δ處理可恢復小鼠學習和記憶能力。激光共聚集熒光顯微鏡下可觀察到過表達CKIIα可促進SET滯留于胞漿，而si14-3-3δ可恢復SET的核輸入。64位陣列系統(tǒng)檢測活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化，發(fā)現(xiàn)過表達CKIIα可以顯著抑制LTP，體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)過表達CKIIα可導致神經(jīng)

24、元樹突長度縮短，分支減少，樹突棘密度減少等變化；免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)在小鼠海馬蛋白中，過表達CKIIα可導致synaptotagmin， synaptophysin， synapsin1， phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)等突觸前蛋白減少，NR2A：NR2B比值變大， SET Ser-9顯著磷酸化，si14-3-3δ處理可以有效恢復上述變化。
　　結論：14-3-3δ可同時結合CKIIα與