正常人肝細(xì)胞、低轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞和高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞表面巖藻糖含量的變化.pdf

1、[背景和目的]
　　 原發(fā)性肝癌(Primarylivercancer，PHC)是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一[1]。隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，其發(fā)病率有逐年上升的趨勢，在我國其死亡率已躍居腫瘤死亡率的第二位，嚴(yán)重地威脅著人類的健康和生命安全[2-4]。原發(fā)性肝癌在組織學(xué)上可以分為三類:肝細(xì)胞型肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)、膽管細(xì)胞型肝癌(Intrahepaticcholangiocarcin

2、oma，IHCC)和混合型肝癌，在我國絕大多數(shù)（90％以上）的原發(fā)性肝癌都是肝細(xì)胞型肝癌[5]。
　　 肝細(xì)胞型肝癌的病因和發(fā)病機制異常復(fù)雜，許多生物學(xué)行為目前還不清楚[6-7]。手術(shù)切除仍是首選的、最有效的治療方法[8]。雖然近年來在肝細(xì)胞型肝癌的早期診斷、早期治療以及基礎(chǔ)研究上取得了顯著的進步，但是肝細(xì)胞型肝癌的預(yù)后仍然較差，即使獲得了根治性切除，5年內(nèi)仍有60％-70％的病人出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[9-11]。
　　 隨著

3、分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及凝集素在糖鏈結(jié)構(gòu)檢測中的應(yīng)用，糖生物學(xué)與腫瘤學(xué)的關(guān)系倍受矚目[12，13]。腫瘤細(xì)胞的諸多生物學(xué)行為與細(xì)胞表面糖基化水平的異常有密切的關(guān)系，許多糖鏈結(jié)構(gòu)甚至被認(rèn)為是“腫瘤相關(guān)碳水化合物抗原(Tumorassociatedcarbohydrateantigens，TACA)[14-16]”,并且認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和免疫逃避等有著密切的關(guān)系。例如，在人乳腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤中可以檢測到N-連接糖鏈β

4、1,6N-乙酰葡糖胺(β1,6G(1)cNAc)的含量異常升高[17-19];LewisX抗原是一種糖類相關(guān)性抗原，可以特異性的識別并結(jié)合選擇素E(一種表達于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附分子)，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移[20-21]。
　　 巖藻糖(Fucose)是廣泛地參與各種糖鏈結(jié)構(gòu)的合成，是糖鏈合成過程中的終末殘基之一[22-24]。真核細(xì)胞表面的糖蛋白或者糖脂中都含有巖藻糖基化的糖鏈，許多研究表明巖藻糖殘基與細(xì)胞的識別、黏附、

5、遷移和生長等有關(guān)[25，26]。腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中常伴有巖藻糖基化的異常，這種異常可能不僅僅是腫瘤細(xì)胞代謝的結(jié)果（或標(biāo)志物），其本身可能還參與腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為，例如，在伴有轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者的血清及尿液中巖藻糖基化的前列腺特異抗原（Prostaticspecificantigen，PSA）要明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者[27];再如，在肺癌患者中，如果巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性升高，往往提示病人的預(yù)后較差，腫

6、瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性大[28,29]。
　　 在肝細(xì)胞型肝癌患者的血清中，巖藻糖苷酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性往往都升高[30，31]。巖藻糖苷酶是一種水解酶，廣泛的分布于人體各種組織細(xì)胞的溶酶體和體液中，其主要的生理功能是參與含巖藻基的糖鏈的分解代謝，臨床上我們可以觀察到，肝細(xì)胞型肝癌患者血清中巖藻糖苷酶的活性異常升高，并已將其作為診斷肝細(xì)胞型肝癌的標(biāo)志物之一;而巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的功能則正好相反，主要參與含巖藻基的糖鏈的合成代謝。細(xì)胞

7、內(nèi)的巖藻糖基化水平主要取決于巖藻糖苷酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的平衡及其活性的高低。那么作為巖藻糖苷酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的重要底物-巖藻糖，有無變化以及有何變化目前還不清楚。而且，目前國內(nèi)外關(guān)于肝細(xì)胞癌發(fā)生過程中巖藻糖基化修飾代謝的研究都集中在血清和腫瘤組織的總體水平上，而與肝癌細(xì)胞諸多生物學(xué)行為直接相關(guān)的細(xì)胞表面的巖藻糖的變化卻未見報道。
　　 因此，我們設(shè)計了本實驗，擬通過流式細(xì)胞儀測定正常人肝細(xì)胞株、低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株和高轉(zhuǎn)移潛

8、能人肝癌細(xì)胞株表面巖藻糖含量的差異，來了解肝細(xì)胞型肝癌發(fā)生過程中細(xì)胞表面巖藻糖含量的變化，以及這種變化與癌變后細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能之間的關(guān)系。
　　 [材料和方法]
　　 1.研究對象
　　 正常人肝細(xì)胞株(L-02)、低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株(MHCC97-L)以及高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株(HCCLM3)，以上三株細(xì)胞均購于中南大學(xué)湘雅中心實驗室。將5×106個肝癌細(xì)胞接種至裸鼠的皮下，MHCC97-L和MHCCLM3肝

9、癌細(xì)胞株的致瘤率均為100％;肝臟原位接種后，MHCC97-L細(xì)胞株的腹壁轉(zhuǎn)移率為20％，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率為0，膈肌轉(zhuǎn)移率為0，肺轉(zhuǎn)移率為40％;肝臟原位接種后，MHCCLM3的腹壁轉(zhuǎn)移率為100％，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率為100％，膈肌轉(zhuǎn)移率為70％，肺轉(zhuǎn)移率為100％[32，33]。
　　 2.細(xì)胞的擴增
　　 正常人肝細(xì)胞株、低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株和高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株，均用含有15％特級胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5

10、％CO2及95％濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，達到融合生長時，用0.25％的胰蛋白酶消化傳代，每株細(xì)胞分成7份，分別接種于不同的培養(yǎng)皿中（共3×7=21份）。而后繼續(xù)用含有15％特級胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2及95％濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞再次達到融合生長時，用0.25％的胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS液洗滌3次，再用PBS液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度均調(diào)整為1×106/ml。
　　 3.實驗分組
　　 取上

11、述的細(xì)胞懸液各500μl，分別加入不同的離心管中，共21管，為樣本管。在裝有正常人肝細(xì)胞(L-02)的7個離心管上依次標(biāo)明N1—N7，為正常肝細(xì)胞組;在裝有低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞(MHCC97-L)的7個離心管上依次標(biāo)明L1—L7，為低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞組;在裝有高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞(HCCLM3)的7個離心管上依次標(biāo)明H1—H7，為高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞組。再用相同的方法取細(xì)胞懸液各500μl，分別加入不同的離心管中，在裝有正常人肝細(xì)胞(L-

12、02)的7個離心管上依次標(biāo)明CN1—CN7，在裝有低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞(MHCC97-L)的7個離心管上依次標(biāo)明CL1—CL7，在裝有高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞(HCCLM3)的7個離心管上依次標(biāo)明CH1—CH7，共21管，為流式細(xì)胞儀檢測過程中樣本管的對照管。
　　 4.巖藻糖含量的檢測
　　 本實驗的主要原理是利用熒光標(biāo)記的荊豆凝聚素(FITC-UEA)能與巖藻糖特異性結(jié)合。在暗室內(nèi)，向樣本管（共21管）中加入10μg熒光

13、標(biāo)記的荊豆凝聚素和PBS液至1000μl;向?qū)φ展埽ü?1管）中加入500μl的PBS液至1000μl。樣本管和對照管均充分混勻后，立即放置于4℃的環(huán)境中，避光孵育1小時。1小時后，取出離心管，用PBS液洗滌細(xì)胞2次（800rpm，離心3分鐘），而后加入300μl1％的多聚甲醛溶液固定，再進行熒光顯微鏡檢查和流式細(xì)胞儀檢測。
　　 5.觀察指標(biāo)
　　 5.1熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光染色的部位和亮度
　　 分別取適

14、量的上述細(xì)胞懸液進行細(xì)胞涂片，并立即在熒光顯微鏡下觀察三株細(xì)胞熒光染色的部位和熒光的亮度。熒光染色的部位表示巖藻糖所在的位置;在相同的曝光時間下，熒光的亮度可以定性地反映巖藻糖含量的高低。
　　 5.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面的平均熒光強度
　　 分別取上述細(xì)胞懸液200μl(至少含有106個細(xì)胞)，立即上機進行流式細(xì)胞儀檢測，測定三株細(xì)胞表面的平均熒光強度。細(xì)胞表面的平均熒光強度可以定量的反映三株細(xì)胞表面巖藻糖含量的多少

15、。
　　 6.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。假設(shè)檢驗水準(zhǔn)α=0.05，采用雙側(cè)檢驗。多組均數(shù)方差齊性，比較正常人肝細(xì)胞株、低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株以及高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株三組細(xì)胞表面的平均熒光強度采用單因素方差分析(One-wayANOVA);比較正常人肝細(xì)胞株與低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株，正常人肝細(xì)胞株與高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株，低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌

16、細(xì)胞株與高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株表面的平均熒光強度，采用LSD法（least-significantdifference，最小顯著差異t檢驗）。
　　 [結(jié)果]
　　 1.熒光顯微鏡下觀察到的結(jié)果
　　 在相同的曝光時間下，我們觀察到正常人肝細(xì)胞株、低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株以及高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞膜均被染成深綠色，但相應(yīng)的細(xì)胞漿和細(xì)胞核則呈弱染色或者未見染色，高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株表面的熒光亮度顯著強于低轉(zhuǎn)移

17、潛能人肝癌細(xì)胞株和正常人肝細(xì)胞株，低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株表面的熒光亮度又高于正常人肝細(xì)胞株。即在正常人肝細(xì)胞株、低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株以及高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞表面巖藻糖含量逐漸增多。
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果
　　 正常人肝細(xì)胞株、低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株和高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株表面均可以檢測到一定數(shù)量的熒光強度，其平均熒光強度分別為(11139.29±496.88)、(14161.14±960.11)和(1