攜帶口蹄疫病毒（FMDV）前導(dǎo)蛋白基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及其在牛腎細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，F(xiàn)MDV)引起的牛、羊、豬等偶蹄動(dòng)物的一種急性接觸性傳染病，發(fā)病率很高，并能形成大范圍流行，給流行的國家和地區(qū)造成極大的政治、經(jīng)濟(jì)損失。隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)在口蹄疫病毒研究中的應(yīng)用，研究者對口蹄疫病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能有了不同程度的了解。其中，口蹄疫病毒的毒性蛋白對于宿主細(xì)胞的毒性作用已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)

2、之一。 本研究以O(shè)型口蹄疫病毒為研究對象，克隆了O型FMDVOA/58毒株前導(dǎo)蛋白(Lpro)編碼基因Lab。利用Swiss-pdbViewer蛋白質(zhì)分析軟件模擬了Lpro的3D模型，發(fā)現(xiàn)其功能活性位點(diǎn)可能是第144位的賴氨酸(Lys)、148位的組氨酸(His)和163位的天冬氨酸(Asp)。并且構(gòu)建了含有Lab基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBPSTR1-Lab。運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法使該重組質(zhì)粒與pVSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于GP2-293

3、包裝細(xì)胞中，收集假病毒。通過電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)直徑約為60nm，外有囊膜，衣殼呈六邊形的病毒粒子存在。用假病毒感染牛腎細(xì)胞(bovinekidneycell，MDBK)，嘌呤霉素抗性篩選陽性細(xì)胞并且加入四環(huán)素抑制Lab基因的表達(dá)。通過12天嘌呤霉素的篩選，待抗性克隆形成時(shí)，利用有限稀釋法挑取單個(gè)抗性細(xì)胞克隆。將單個(gè)抗性克隆分別擴(kuò)大培養(yǎng)后，經(jīng)除去四環(huán)素誘導(dǎo)整合于宿主細(xì)胞基因組中的Lab基因表達(dá)，挑選出能在較短時(shí)間內(nèi)使MDBK細(xì)胞發(fā)生病變的陽性

4、細(xì)胞株進(jìn)行傳代培養(yǎng)。利用PCR手段，證實(shí)Lab基因被整合到MDBK細(xì)胞基因組中，并能穩(wěn)定地隨宿主細(xì)胞傳代；利用RT-PCR檢測手段，證實(shí)Lab基因在無四環(huán)素的情況下能夠被轉(zhuǎn)錄。將第35代陽性細(xì)胞除去四環(huán)素后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集均發(fā)生病變的細(xì)胞，應(yīng)用Wensten-blotting檢測手段鑒定Lpro的表達(dá)。結(jié)果顯示，目的蛋白與O型FMDV抗血清能特異性反應(yīng)。這表明，目的蛋白具有與O型FMDV感染宿主細(xì)胞后產(chǎn)生的Lpro相同的活性。