CCDC154基因?qū)毎L的調(diào)控及其分子機制.pdf

1、目的:
　　 CCDC154是一個全新的功能基因。前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)CCDC154與石骨癥相關(guān)，但其具體的生物學(xué)功能目前仍不清楚。為了深入探討CCDC154基因的生物學(xué)功能，我們克隆人CCDC154基因，并通過體外實驗研究該基因的生物學(xué)特性、功能及其作用的分子機理。
　　 方法:
　　 1)從HEK293細胞中提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)克隆CCDC154編碼序列，利用生物信息學(xué)工具分析其結(jié)構(gòu);
　

2、　 2)構(gòu)建CCDC154真核表達載體，在HEK293及Hela細胞中瞬時或穩(wěn)定高表達CCDC154基因，利用克隆形成、MTT、軟瓊脂等實驗檢測CCDC154在細胞生長調(diào)控中的作用。
　　 3)通過流式細胞技術(shù)檢測細胞周期及Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達，分析CCDC154基因調(diào)控細胞生長的分子機理。
　　 4)構(gòu)建不同的CCDC154基因缺失突變體，通過克隆形成實驗檢測CCDC154調(diào)控細胞生長的結(jié)構(gòu)域。<

3、br>　　 結(jié)果:
　　 1)成功克隆了CCDC154編碼序列，長2001 bp，編碼667個氨基酸。蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，CCDC154含有多個coiled-coil domain和周期蛋白結(jié)合域。
　　 2)在HEK293和Hela細胞中瞬時過表達CCDC154顯著抑制細胞生長。CCDC154過表達細胞形成的克隆數(shù)目明顯減少;MTT細胞活性測定顯示，CCDC154過表達細胞的生長活性明顯降低。
　　 3)穩(wěn)定

4、過表達CCDC154顯著抑制HEK293和Hela細胞生長，并且體外成瘤顯示，穩(wěn)定過表達CCDC154明顯抑制Hela細胞形成的克隆大小。
　　 4)細胞周期分析結(jié)果顯示，穩(wěn)定過表達CCDC154導(dǎo)致HEK293細胞在G2/M期發(fā)生阻滯，G2/M期細胞數(shù)目提高兩倍以上。
　　 5) Western Blot結(jié)果顯示，過表達CCDC154導(dǎo)致HEK293細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin B1，Cdc2表達下調(diào)，p21、Chk1