雛雞心肌細胞原代培養(yǎng)及錳對肉仔雞心肌細胞MnSOD基因表達調控研究.pdf

1、MnSOD是動物體內重要的抗氧化劑，能催化分解生物體氧化過程中產(chǎn)生的有毒物O2-·為O2和H2O2，從而防治多種與之有關的疾病，具有抗氧化應激和抗癌的功能。肉仔雞的生長發(fā)育快，體內代謝比較旺盛，代謝過程中產(chǎn)生的有毒O2-·較多，尤其是在心臟等代謝旺盛的器官。MnSOD是肉仔雞體內一種重要O2-·清除劑，在肉仔雞抗氧化應激體系中起關鍵作用，而錳作為MnSOD的組成部分，對MnSOD基因的表達調控發(fā)揮著重要作用。本研究采用體外法研究錳對肉仔

2、雞心肌細胞MnSOD基因的表達調控作用。研究分為三個部分：(1)雛雞心肌細胞原代培養(yǎng)；(2)錳對肉仔雞心肌細胞MnSOD活性的影響；(3)錳對肉仔雞心肌細胞MnSOD mRNA表達的影響。 1.采用組織貼塊法和酶消化法結合差速貼壁法培養(yǎng)肉仔雞心肌細胞，并對培養(yǎng)的細胞進行免疫細胞化學染色以鑒定是否為心肌細胞。分別應用胰蛋白酶和膠原酶對心肌組織塊進行消化，通過觀察細胞成活率以判定哪種消化酶更適合心肌組織的消化，應用0.12％的膠原酶

3、對心肌組織分別消化5min、10min、15min，確定較好的消化時間。利用MDM、DMEM/F12、DMEM三種培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細胞，篩選合適的培養(yǎng)基。結果表明：貼塊法簡便、易操作，但是心肌細胞收獲周期長，純度相對較低，酶消化法操作相對較復雜，但是細胞收獲周期短，純度較高，采用差速貼壁和添加Brdu的方法來抑制成纖維細胞的增殖，能較好的控制心肌細胞純度；免疫細胞化學染色結果表明，培養(yǎng)的細胞為心肌細胞。膠原酶比胰蛋白酶更適合雞心肌組織塊的

4、細胞分離消化；0.12％的Ⅰ型膠原酶37℃分次消化，每次消化10min能夠較好的分離心肌細胞；MDM和DMEM/F12培養(yǎng)基比DMEM培養(yǎng)基更適合雞心肌細胞的培養(yǎng)。 2.將經(jīng)缺錳飼糧飼喂7d的肉仔雞處死后用于雞心肌細胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)5～7d長成單層的心肌細胞分別加入含0.1、0.5、1.0、2mM/L無機硫酸錳的培養(yǎng)基溶液，同時設不加錳的對照組，每個處理3個重復，每個重復2細胞培養(yǎng)孔，在加入培養(yǎng)液后的6、12、24、48h時分別采

5、集細胞。按照超氧化物歧化酶(SOD)分型測試盒提供的方法測定肉仔雞心肌細胞MnSOD的活性。結果表明：添加0.1、0.5、1.0mM/L濃度錳的心肌細胞MnSOD活性與不加錳的心肌細胞MnSOD活性無顯著差異，而添加2.0mM/L濃度錳的心肌細胞MnSOD活性要顯著高于其他各組的MnSOD活性；添加錳后的6～24h里心肌細胞MnSOD活性變化不大，當培養(yǎng)至48h時心肌細胞MnSOD活性有明顯升高。由此可知，用2.0mM/L無機硫酸錳處理

6、心肌細胞48h，其MnSOD活性升高最大。 3.將經(jīng)缺錳飼糧飼喂7d的肉仔雞處死后用于雞心肌細胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)5～7d長成單層的心肌細胞分別加入含0.1、0.5、1.0、2mM幾無機硫酸錳的培養(yǎng)基溶液，同時設不加錳的對照組，每個處理3個重復，每個重復2細胞培養(yǎng)孔，在加入培養(yǎng)液后的6、12、24、48h時分別提取細胞的總RNA。經(jīng)純化后，用熒光定量PCR法對MnSOD mRNA進行定量。結果表明：用加錳培養(yǎng)基分別培養(yǎng)心肌細胞6、12、48h