化學(xué)性缺氧對(duì)原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響.pdf

1、急性心肌缺血/缺氧伴隨著葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的增加，這對(duì)保護(hù)心肌免受不可逆性缺血/缺氧損傷非常重要，然而關(guān)于心肌缺血/缺氧激發(fā)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制仍不清楚。已知葡萄糖經(jīng)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞是心肌葡萄糖代謝的第一步，其轉(zhuǎn)運(yùn)速度由細(xì)胞膜上易化性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transport proteins，GLUTS)GLUT1和GLUT4的數(shù)量決定。體內(nèi)和體外的研究均表明胰島素可誘導(dǎo)心肌GLUTl和GLUT4從細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，通過增加心肌細(xì)

2、胞膜GLUT1和GLUT4數(shù)量進(jìn)而易化葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。 在此，我們以原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，利用疊氮鈉(sodi啪azide,NaN<,3>)一特異性細(xì)胞色素C氧化酶抑制劑，制作缺氧模型模擬心肌細(xì)胞化學(xué)性缺氧，通過與胰島素的對(duì)比來研究缺氧單獨(dú)或聯(lián)合胰島素對(duì)大鼠心肌細(xì)胞GLUTs轉(zhuǎn)位的影響。旨在進(jìn)一步探索心肌細(xì)胞缺氧條件下能量利用的分子生物學(xué)機(jī)制，以對(duì)缺血/缺氧心肌的保護(hù)提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料和方法： 1．

3、大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 消化分離的Wistar大鼠乳鼠(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部)心室肌細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM中，利用差速黏附技術(shù)提純心肌細(xì)胞后，以10<'5>個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶，置37℃，10％CO<,2>培養(yǎng)箱(德國(guó)KENDRO／HERAEUS)中靜止培養(yǎng)，每2-3天換液一次。 2．2-[<'3>H]-脫氧葡萄糖的攝取 用0～50mmol/L胰島素溶液(溶于DMEM

4、)37℃孵育細(xì)胞5～60分鐘，再用1μCi/ml 2-[<'3>H]-脫氧葡萄糖(2-[<'3>H]deoxyglucose，2-[<'3>H])(北京原子高科核技術(shù)有限公司)孵育細(xì)胞60min，冷根皮素(phloretin)終止反應(yīng)。紙片法行液閃測(cè)量。 3．制備心肌細(xì)胞缺氧模型及分組 PBS沖洗細(xì)胞后，將原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組，胰島素組(20mmol/L胰島素)，疊氮鈉模擬的化學(xué)性缺氧組(1 mmol/L

5、疊氮鈉)及化學(xué)性缺氧聯(lián)合胰島素組(1 mmol/L疊氮鈉+20 mmol/L胰島素)。 4．分離細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)膜 孵育結(jié)束后，離心收集細(xì)胞并勻漿。利用差速離心及非連續(xù)蔗糖密度梯度(32％，40％，50％)分離細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)膜。所有過程4℃進(jìn)行。 5．SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白印跡雜交(Western-Blot) 等量蛋白樣品加入到預(yù)制的10％SDS．聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，再轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。封

6、閉后，分別同多克隆抗GLUT4抗體(美國(guó)Chemicon公司)及多克隆抗GLUTl抗體(美國(guó)Santa公司)4℃孵育過夜。再同相應(yīng)二抗室溫孵育2小時(shí)，然后將膜浸入顯色液中顯色分析結(jié)果。 結(jié)果: 1．原代培養(yǎng)的大鼠心室肌細(xì)胞一周左右長(zhǎng)滿瓶皿底壁，形成細(xì)胞單層，搏動(dòng)同步化。 2．0．1～50mmol/L，胰島素溶液均使原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞對(duì)2-[<'3>H]DG平均攝取率增加。胰島素濃度為20mmol/L、作用時(shí)間為

7、30分鐘時(shí)，細(xì)胞對(duì)2-[<'3>H]DG攝取率最高。 3．Western-Blot分析結(jié)果表明，同對(duì)照組相比，各處理組細(xì)胞膜GLUT4表達(dá)量顯著增加；同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)膜GLUT4表達(dá)量相應(yīng)下降，提示各實(shí)驗(yàn)組GUJT4在不同程度上發(fā)生了從細(xì)胞內(nèi)膜向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位。其中，胰島素組GLUT4轉(zhuǎn)位程度高于缺氧組，缺氧聯(lián)合胰島素組則發(fā)生最大程度轉(zhuǎn)位，提示二者對(duì)GLuT4轉(zhuǎn)位發(fā)生了疊加效應(yīng)。 4．各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膜GLUT1表達(dá)量也有所增加，

8、但增加程度不如GLUT4明顯；同樣條件下，細(xì)胞內(nèi)膜GLUT1表達(dá)量相應(yīng)下降，提示各實(shí)驗(yàn)組GLUT1也發(fā)生不同程度從細(xì)胞內(nèi)膜向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位。與GLUT4相似，胰島素組GLUT1轉(zhuǎn)位程度高于缺氧組，胰島素聯(lián)合缺氧組轉(zhuǎn)位程度最大，提示二者對(duì)GLUT1轉(zhuǎn)位也發(fā)生了疊加效應(yīng)。 討論: 代謝應(yīng)激時(shí)，如缺血或缺氧，葡萄糖成為心肌主要能量來源。已知代謝應(yīng)激期間心肌葡萄糖攝取的增加對(duì)細(xì)胞存活和心肌功能有保護(hù)性作用。因此明確心肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)

9、制對(duì)病理狀態(tài)下心肌能量代謝的糾正及心功能改善具有重要臨床意義。 體外原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞排除了體內(nèi)神經(jīng)體液因素的干擾，又最大程度保持心肌原有特性，且實(shí)驗(yàn)因素的濃度和活動(dòng)易被調(diào)節(jié)，因此能成為研究心肌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一個(gè)較好模型。我們利用疊氮鈉(NaN<,3>)模擬細(xì)胞化學(xué)性缺氧，研究胰島素、缺氧兩者單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞GLUT1轉(zhuǎn)位的影響，進(jìn)一步探索心肌細(xì)胞缺氧條件下葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。 數(shù)據(jù)表明，同對(duì)照

10、組相比，胰島素和疊氮鈉模擬的化學(xué)性缺氧單獨(dú)或聯(lián)合作用均增加了體外原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞膜GLUTs的表達(dá)量，而細(xì)胞內(nèi)膜GLUTs相應(yīng)下降，提示在此條件下心肌細(xì)胞發(fā)生了GLUTs由細(xì)胞內(nèi)膜向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位。數(shù)據(jù)表明胰島素誘導(dǎo)的GLUTs轉(zhuǎn)位幅度大于化學(xué)性缺氧的作用，而化學(xué)性缺氧后給予胰島素則激發(fā)了更大幅度的轉(zhuǎn)位，這說明化學(xué)性缺氧聯(lián)合胰島素對(duì)GLUTs轉(zhuǎn)位發(fā)生了疊加效應(yīng)。 缺氧和胰島素引起GLUTs轉(zhuǎn)位程度的不同很可能是由于激發(fā)了不同

11、的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，二者對(duì)GLUTs轉(zhuǎn)位的疊加性也證實(shí)了這一點(diǎn)。其中，胰島素激發(fā)GLUT4轉(zhuǎn)位依賴于P13K途徑；而．AMPK則是缺氧缺血調(diào)節(jié)GLUT4轉(zhuǎn)位的一個(gè)主要因素。同GLUT4類似，胰島素誘導(dǎo)的細(xì)胞GLUT1轉(zhuǎn)位需要P13K的激活；但缺血激發(fā)GLUT1轉(zhuǎn)位與P13K信號(hào)機(jī)制無關(guān)，提示調(diào)節(jié)GLUTl轉(zhuǎn)位至少存在兩條不同的路徑。數(shù)據(jù)還表明胰島素和缺氧誘導(dǎo)的GLUT1轉(zhuǎn)位幅度小于GLUT4，表明在心肌細(xì)胞中調(diào)節(jié)GLUT1轉(zhuǎn)位的方式不

12、同于GLUT4。 化學(xué)性缺氧聯(lián)合胰島素對(duì)GLUTs轉(zhuǎn)位的疊加效應(yīng)有重要的臨床意義。此作用可更大程度增加細(xì)胞膜表面GLUTs數(shù)量，使細(xì)胞外葡萄糖更多的攝入細(xì)胞內(nèi)，以滿足缺血/缺氧心肌的能量需要，有助于缺血/缺氧心肌代謝和機(jī)械功能的穩(wěn)定。 結(jié)論: 1．胰島素增加了原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞對(duì)2-[<'3>H]DG的攝取率，20mmol/L的胰島素濃度孵育細(xì)胞30分鐘使心肌對(duì)2-[<'3>H]DG攝取率達(dá)到峰值。 2