穩(wěn)定表達(dá)雞氨肽酶N的MDCK細(xì)胞系建立及其初步鑒定.pdf

1、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)是冠狀病毒科（Coronaviridae）的單股正鏈RNA病毒。臨床上傳染性支氣管炎(IB)可以導(dǎo)致患病雞產(chǎn)蛋量下降，肉雞的生長速度減慢，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。IBV不同血清型的毒株眾多，在同一地區(qū)可能同時出現(xiàn)多個血清型的毒株，且他們之間交叉保護(hù)效果較低，給IB的綜合防治帶來巨大的困難。IB致病機(jī)制的闡明，尤其是對IBV感染宿主細(xì)胞過程的研究是該病防治的基礎(chǔ)，有研究表明雞氨肽酶N(cAPN)在IBV感

2、染宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步研究cAPN的生物學(xué)功能及其對IBV感染宿主細(xì)胞的影響，我們開展了穩(wěn)定表達(dá)cAPN的MDCK細(xì)胞系建立及其初步特性的研究。
　　本文構(gòu)建了pET30a-cAPN原核重組質(zhì)粒，鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta宿主菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE表明重組表達(dá)蛋白分子量為113Ku，且以包涵體的形式表達(dá)。重組蛋白純化和復(fù)性后作為免疫原免疫新西蘭大白兔制備其多克隆抗體。為了進(jìn)行cAPN穩(wěn)定表達(dá)細(xì)

3、胞系的篩選，將pcDNA3.1-cAPN轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，通過G418篩選和多次克隆篩選出穩(wěn)定表達(dá)cAPN基因的細(xì)胞株，RT-PCR和間接免疫熒光檢測表明cAPN在獲得的MDCK細(xì)胞中可以穩(wěn)定表達(dá)，并命名為MDCK-cAPN。病毒感染實驗表明IBV可以感染MDCK-cAPN細(xì)胞，并且在接種后24 h后出現(xiàn)了典型的細(xì)胞病變，而對照MDCK細(xì)胞不能感染IBV，說明cAPN在IBV感染細(xì)胞的過程中可能作為細(xì)胞受體發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。總之，