非轉(zhuǎn)染人角膜基質(zhì)細(xì)胞系的建立、鑒定及其克隆化研究.pdf

1、角膜(cornea)是位于眼球最前部的一層透明膜，能為眼睛提供大部分的屈光力，加上晶體的屈光力，便可使光線準(zhǔn)確聚焦在視網(wǎng)膜上成像。人角膜基質(zhì)(HumanCorneal Stroma.HCS)是角膜構(gòu)成的主要部分，占角膜厚度的90％，在維持角膜透明及允許光線穿過中具有至關(guān)重要的作用。很多原因均可引起HCS發(fā)生異常性病變，且HCS病變具有患病率高、致盲性強(qiáng)和臨床治療困難等特點(diǎn)。目前唯一的治療辦法是進(jìn)行角膜移植術(shù)，但由于捐獻(xiàn)角膜的高度匱乏，致

2、使絕大多數(shù)叫膜基質(zhì)異?；颊咭驘o法得到供體角膜而不能復(fù)明。近年來，角膜組織工程的興起使體外重建組織工程人角膜基質(zhì)(Tissue-Engineered Human Corneal Stroma，TE-HCS)成為可能，也給眾角膜基質(zhì)異?；颊邘砹酥匾姽饷鞯南Ｍ?。在TE-HCS的體外重建中，大量正常HCS種子細(xì)胞的來源和理想載體支架的獲得是急需解決的兩個(gè)關(guān)鍵問題，尤其是HCS種子細(xì)胞的來源問題更是制約TE-HCS規(guī)模化體外重建的瓶頸。雖然已有

3、利用癌基因轉(zhuǎn)染建立人角膜基質(zhì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞(Human Corneal Stromal Cell，HCSC)細(xì)胞系的報(bào)道，但因這類細(xì)胞具有潛在致瘤性而無法應(yīng)用于臨床，而建立非轉(zhuǎn)染、無致瘤性的HCSC細(xì)胞系被認(rèn)為是解決大量正常HCS種子細(xì)胞來源問題的希望。但目前為止，仍未見成功建立非轉(zhuǎn)染、無致瘤性的HCSC細(xì)胞系有關(guān)報(bào)道。為了解決HCSC種子細(xì)胞來源問題，本文利用胰酶消化聯(lián)合組織塊貼壁法啟動(dòng)了HCSC的原代培養(yǎng)，通過添加促貼壁、生長(zhǎng)和分裂

4、的物質(zhì)獲得可繼代培養(yǎng)的HCSC，建立非轉(zhuǎn)染HCSC細(xì)胞系，并對(duì)其細(xì)胞屬性、功能蛋白表達(dá)和致瘤性進(jìn)行鑒定，進(jìn)而利用克隆化培養(yǎng)方法從此細(xì)胞系中篩選出單克隆細(xì)胞株，經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后再次進(jìn)行細(xì)胞屬性等鑒定，為利用細(xì)胞屬性正常的單克隆細(xì)胞株開展HCSC相關(guān)理論研究和TE-HCS的體外重建研究奠定基礎(chǔ)。
　　 為了建立非轉(zhuǎn)染HCSC細(xì)胞系，本文將撕除角膜內(nèi)皮層和上皮層得到的HCS片進(jìn)行了胰蛋白酶適度消化，然后將組織塊平貼于用明膠包被的24孔板中

5、，加入含5％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的DMEM/F-12培養(yǎng)液置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)。24 h后將培養(yǎng)液更換為HCSC專用培養(yǎng)液，即含有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EpidermalGrowth Factor，EGF)、硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate，CS)、羧甲基殼多糖(Carbox

6、ymethy1 Chitosan，CM-CH)和20％FBS的DMEM/F-12完全培養(yǎng)液。跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)培養(yǎng)2 d后組織塊周圍開始有纖維樣細(xì)胞遷出，14 d便可長(zhǎng)成完整的細(xì)胞單層，進(jìn)而利用HCSC專用培養(yǎng)液成功進(jìn)行了繼代培養(yǎng)。觀察結(jié)果顯示，HCSC貼壁能力強(qiáng)，在體外呈現(xiàn)穩(wěn)定的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，且生長(zhǎng)分裂旺盛并能穩(wěn)定持續(xù)傳代，細(xì)胞經(jīng)凍存復(fù)蘇后依然保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)和增殖能力，現(xiàn)已傳至第40代。
　　 為了鑒定所建立的非轉(zhuǎn)染H

7、CSC細(xì)胞系的屬性和潛能，本文對(duì)第40代HCSC細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)特性、核型以及功能蛋白的表達(dá)等進(jìn)行了鑒定。細(xì)胞屬性檢測(cè)結(jié)果顯示，第40代HCSC依然呈典型的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，能活躍生長(zhǎng)和分裂，其群體倍增時(shí)間為41.44 h，該細(xì)胞系細(xì)胞雖然出現(xiàn)了染色體的非整倍性，但其特征性染色體數(shù)目依然46條，并具有典型的人類染色體特征；對(duì)HCSC細(xì)胞系的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，該細(xì)胞系細(xì)胞仍具有HCSC特異性標(biāo)志蛋白--波形蛋白的陽性表達(dá)，綜合核型特征

8、可知，本文所建立的非轉(zhuǎn)染細(xì)胞系確為HCSC細(xì)胞系。為了鑒定所建立細(xì)胞系的潛能，本文又對(duì)該細(xì)胞系細(xì)胞進(jìn)行了功能蛋白--細(xì)胞連接蛋白和膜運(yùn)輸?shù)鞍妆磉_(dá)的免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系仍具有細(xì)胞連接蛋白--間隙連接蛋白CX-43和整聯(lián)蛋白β1的陽性表達(dá)，也保持有膜運(yùn)輸?shù)鞍?-鈉鉀泵和鈣泵的陽性表達(dá)，表明該細(xì)胞系細(xì)胞仍具有形成細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間細(xì)胞連接的潛能，還保持有對(duì)Na+、K+和Ca2+主動(dòng)運(yùn)輸?shù)臐撃?。可見，本文所建立的非轉(zhuǎn)染細(xì)胞系不僅

9、具有HCSC的屬性，而且還保持有細(xì)胞連接蛋白和膜運(yùn)輸?shù)鞍椎年栃员磉_(dá)，具有行使正常HCSC功能的潛力。
　　 為了獲得可用于TE-HCS體外重建的核型正常的HCSC種子細(xì)胞，本文又利用克隆化培養(yǎng)技術(shù)對(duì)已建立非轉(zhuǎn)染HCSC細(xì)胞系進(jìn)行了克隆化研究。利用有限稀釋法對(duì)HCSC細(xì)胞系進(jìn)行了克隆化實(shí)驗(yàn)，共獲得了15個(gè)單克隆細(xì)胞株，核型鑒定結(jié)果顯示，有3個(gè)單克隆細(xì)胞株的染色體數(shù)目為46條且具有正常二倍體核型。取其中一個(gè)單克隆細(xì)胞株C5G再次進(jìn)行

10、生長(zhǎng)特性的鑒定和標(biāo)志蛋白表達(dá)的檢測(cè)。鑒定與檢測(cè)結(jié)果顯示，該單克隆細(xì)胞株細(xì)胞群體倍增時(shí)間為40.39 h，仍保持有旺盛的生長(zhǎng)分裂活性，并具有波形蛋白的陽性表達(dá)，說明該細(xì)胞株確為HCSC單克隆細(xì)胞株，可被用作種子細(xì)胞進(jìn)行TE-HCS及全層角膜的體外重建研究。
　　 綜上所述，本文成功建立了細(xì)胞屬性和功能蛋白表達(dá)正常的非轉(zhuǎn)染。HCSC細(xì)胞系，并從中篩選出了細(xì)胞屬性正常的單克隆細(xì)胞株，初步解決了足量HCSC種子細(xì)胞的來源問題，為TE-H