NRAGE基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染食管癌細胞系的建立及其放射抗性機制研究.pdf

1、目的：
　　食管癌是全球威脅人類生命和健康的最常見惡性腫瘤之一，我國每年食管癌發(fā)病人數(shù)占全球發(fā)病總?cè)藬?shù)的一半以上，以食管鱗癌最為常見。放射治療是食管癌三大治療手段之一，而放射抵抗性是導(dǎo)致其治療失敗的主要原因。我們前期研究發(fā)現(xiàn)NRAGE在放射抗性細胞株TE13R120中表達量明顯高于親本TE13細胞，且NRAGE亞細胞定位變化可能參與了食管癌細胞放射抗性的形成。本研究旨在通過基因轉(zhuǎn)染構(gòu)建NRAGE穩(wěn)定表達的食管癌細胞系，采用Real

2、-Time PCR和Western Blot驗證轉(zhuǎn)染效果，并通過細胞克隆形成實驗、流式細胞術(shù)等觀察該基因影響放射抗性的具體機制，進一步明確NRAGE基因與食管鱗癌細胞放射抗性的關(guān)系，為將來NRAGE基因在食管癌放射治療中的研究提供細胞模型及實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1采用Real-Time PCR及Western Blot檢測3種食管癌細胞系（TE13、Eca109、Kyse170）中NRAGE的mRNA及蛋白表達情況，選

3、擇NRAGE低表達細胞進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
　　2以脂質(zhì)體為載體，將攜有NRAGE基因的真核表達質(zhì)粒p3XFLAG-CMV-14-NRAGE轉(zhuǎn)染NRAGE低表達的細胞,實驗分二組， NRAGE基因轉(zhuǎn)染組(Eca109/NRAGE組)和空白對照組（Eca109組）。采用G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系（Eca109/NRAGE）。
　　3采用Real-Time PCR及Western Blot驗證轉(zhuǎn)染組和空白對照組細胞中NRAGE基

4、因的表達。
　　4采用平板克隆形成實驗比較轉(zhuǎn)染組和空白對照組細胞的放射抗性，探討該基因?qū)κ彻荀[癌細胞放射抗性的影響。
　　5應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染組和空白對照組細胞的細胞周期變化。
　　6通過流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染組和空白對照組細胞的凋亡情況。
　　7應(yīng)用Real-Time PCR及Western Blot驗證兩組細胞中β-catenin基因的表達。
　　結(jié)果：
　　1 Real-Time PCR及Wes

5、tern Blot結(jié)果顯示NRAGE的mRNA及蛋白表達水平在Eca109細胞中最低，因此選擇Eca109細胞進行以下試驗。
　　2 Real-Time PCR及Western Blot結(jié)果證實轉(zhuǎn)染組NRAGE的mRNA及蛋白表達均高于空白對照組(P=0.000)，證明外源性NRAGE基因已整合于細胞基因組中，并獲得穩(wěn)定表達。
　　3平板克隆形成實驗證明Eca109與Eca109/NRAGE組細胞的放射敏感性不同，（D0值分

6、別為1.54和1.76Gy，Dq值分別為1.29和1.41Gy，SF2值分別為0.44和0.51，N值分別為1.838和1.802)。轉(zhuǎn)染組細胞的D0、Dq值均增大，且SF2值是是空白對照組細胞的1.159倍，細胞存活曲線肩區(qū)增寬，這均提示NRAGE轉(zhuǎn)染組細胞比空白對照組更具有放射抗性。
　　4流式細胞技術(shù)分析顯示，與對照組細胞相比，轉(zhuǎn)染組細胞中對射線抵抗性最強的S期細胞比例增加，而對射線最敏感的G2/M期減少。
　　5細胞

7、凋亡檢測表明，Eca109/NRAGE組細胞凋亡率較Eca109組細胞降低（P=0.0029）。
　　6 Real-Time PCR及Western Blot結(jié)果顯示β-catenin的mRNA及蛋白表達在Eca109/NRAGE組細胞中的表達量明顯高于Eca109組細胞(P=0.000)。
　　結(jié)論：
　　1通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，可以建立NRAGE基因穩(wěn)定表達的食管癌細胞系。
　　2 NRAGE參與了Eca109/N