巨型艾美耳球蟲Emgam56基因在畢赤酵母中的表達及其免疫保護性研究.pdf

1、雞球蟲病是由多種艾美耳球蟲（Eimeria）寄生于雞腸道黏膜上皮細胞內所引起的一種寄生原蟲病，不僅引起雞發(fā)病死亡，還可嚴重影響雞的生長發(fā)育，降低飼料報酬。目前雞球蟲病的防治主要依靠化學藥物，其次是雞球蟲病活疫苗。隨著抗球蟲藥物的廣泛與大量使用，球蟲耐藥性以及人們對藥物殘留肉蛋、污染環(huán)境等諸多問題也隨之出現(xiàn)。同時活球蟲疫苗又存在生產成本高、容易擴散病原、容易引起腸炎發(fā)生等弊端。為此，亞單位疫苗已成為雞球蟲病疫苗的發(fā)展方向。CoxAbic(

2、R)是由巨型艾美耳球蟲（E.maxima）配子體蛋白EmGam56、EmGam82和EmGam230組成的一種亞單位疫苗，在其生產過程中需從感染雞體分離純化配子體，然后再用親和柱層析的方法分離純化配子體蛋白，因此生產費時、成本昂貴。利用基因重組技術研制基因工程疫苗可能解決這一難題。
　　巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)是一種真核表達系統(tǒng)，不僅具有操作簡單、生長速度快、發(fā)酵成本低廉等優(yōu)點，還具有高等真核表達系統(tǒng)的蛋白翻譯后的加工修飾功能，該系

3、統(tǒng)所表達產物的免疫學活性和生物學功能與天然蛋白質更為接近。因此，本研究在巴斯德畢赤酵母中表達了E.maxima配子體蛋白Emgam56基因，檢測了酵母表達蛋白rEmGam56的抗原特異性和免疫原性，并通過動物免疫保護試驗比較分析了酵母表達蛋白rEmGam56和原核表達蛋白rEmGam56對E.maxima的免疫保護效果，為重組配子體抗原亞單位疫苗的研制奠定基礎。
　　1.巨型艾美耳球蟲Emgam56基因的畢赤酵母表達及其初步鑒定<

4、br>　　根據(jù)Emgam56基因去除信號肽后的ORF序列和真核表達載體pPICzαA的酶切位點設計一對特異性引物，以本實驗室保存的重組質粒pGEM-T-Emgam56為模板，PCR擴增出目的片段，插入表達載體pPICzαA中，構建重組表達質粒pPICzαA-Emgam56。對酶切鑒定和PCR鑒定為陽性的重組質粒進行測序，將連接正確的重組質粒線性化后用電穿孔法轉化到畢赤酵母GS115，利用博萊霉素(Zeocin)抗性篩選多拷貝重組菌株，搖

5、瓶水平進行誘導表達，所得蛋白大小約為11.6kDa，且能被6×HIS單抗識別。
　　2.巨型艾美耳球蟲畢赤酵母重組表達蛋白rEmGam56的免疫原性分析
　　分別以鼠抗酵母表達蛋白rEmGam56多克隆抗體、鼠抗原核表達蛋白rEmGam56多克隆抗體和E.maxima雞康復血清為一抗，對酵母表達蛋白rEmGam56進行Western-blot檢測，結果顯示該蛋白具有良好的免疫原性。以酵母表達蛋白rEmGam56為抗原，用間接

6、ELISA方法檢測鼠抗酵母表達蛋白rEmGam56多抗、原核表達蛋白rEmGam56多抗和雞康復血清，顯示該重組蛋白能刺激機體產生一定的抗體水平，并且能識別雞康復血清中的特異性抗體。
　　3.巨型艾美耳球蟲畢節(jié)酵母重組表達蛋白rEmGam56的免疫保護效果
　　以雛雞為試驗動物，以死亡率、相對增重率、病變記分減少率與相對卵囊產量、細胞免疫和體液免疫水平等為評價指標，對酵母表達蛋白rEmGam56的免疫保護效果進行了初步研究，