ROS效應(yīng)蛋白Nrf2介導(dǎo)α-珠蛋白穩(wěn)定蛋白(AHSP)在β-地貧狀態(tài)下的反饋升高.pdf

1、地中海貧血是人類最為常見的單基因遺傳性疾病之一。當(dāng)珠蛋白基因發(fā)生突變時(shí)，一種或多種珠蛋白肽鏈的合成受阻，最終導(dǎo)致α-珠蛋白肽鏈和β-珠蛋白肽鏈的合成不平衡。游離的珠蛋白肽鏈?zhǔn)菑?qiáng)氧化劑，可以催化產(chǎn)生活性氧自由基ROS。ROS的產(chǎn)生可以破壞紅系前體細(xì)胞和成熟的紅細(xì)胞，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致凋亡。凋亡的紅系前體細(xì)胞累積即可導(dǎo)致無效的紅系生成，其癥狀即為貧血。另外，游離的珠蛋白不穩(wěn)定而易發(fā)生沉淀或降解。珠蛋白在紅細(xì)胞膜上的沉淀會破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致溶血性貧血。

2、降解的珠蛋白釋放有毒的血紅素、卟啉和鐵離子等，這些游離的離子也會催化產(chǎn)生ROS。ROS的產(chǎn)生是關(guān)于地中海貧血的分子病理學(xué)的重要內(nèi)容。
　　 目前關(guān)于地中海貧血的治療主要分為三類，輸血、利用鐵螯合劑去除血液中過量的鐵離子和利用激素進(jìn)行內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等方法是對癥治療，可以在一段時(shí)間內(nèi)減輕地中海貧血的臨床癥狀，但需終生用藥；而通過異體骨髓移植、藥物開啟胎兒型珠蛋白基因的表達(dá)和利用抗氧化劑等方法則是從病因出發(fā)，可以在一定程度上改善地中海貧血

3、癥狀，但仍面臨排異反應(yīng)，藥物毒性等因素的困擾；另外有關(guān)地中海貧血基因治療的方法也在艱難探索中。
　　 α-珠蛋白穩(wěn)定蛋白AHSP是新近發(fā)現(xiàn)的α-珠蛋白特異的分子伴侶。AHSP的結(jié)構(gòu)決定其功能，通過結(jié)合并穩(wěn)定各種形式的α-珠蛋白，AHSP可以減少ROS的產(chǎn)生，在正常的紅系發(fā)生和地貧發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。以AHSP為靶標(biāo)，尋找可以預(yù)防地貧發(fā)生，緩解或者改善地貧癥狀的藥物是很有前景的地貧治療方案。因此關(guān)于AHSP表達(dá)調(diào)節(jié)的研究顯

4、得尤為重要。
　　 AHSP是作為GATA-1的靶基因被發(fā)現(xiàn)的，GATA-1對AHSP的調(diào)節(jié)作用也是最早被詳細(xì)闡明的。Gallagher等人通過5’RACE的方法首先鑒定了AHSP啟動子區(qū)的5’端，進(jìn)一步結(jié)合多種實(shí)驗(yàn)手段證明了GATA-1和廣譜的轉(zhuǎn)錄因子Oct-1在AHSP調(diào)控區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，以人AHSP啟動子導(dǎo)向的報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)特異地在骨髓、脾和網(wǎng)織紅細(xì)胞等紅系組織中表達(dá)。Pilon等人進(jìn)一步在細(xì)胞和動物水平證明了EKL

5、F對AHSP的轉(zhuǎn)錄激活作用，同時(shí)，EKLF作為染色質(zhì)調(diào)節(jié)子還可以改變AHSP的染色質(zhì)水平。另有文獻(xiàn)報(bào)道表明組蛋白去乙?；敢种苿┖图?xì)胞內(nèi)的鐵的水平都可以調(diào)節(jié)AHSP的表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)游離的鐵可以通過與鐵調(diào)節(jié)蛋白相互作用而去穩(wěn)定AHSP的mRNA的穩(wěn)定性，從而負(fù)調(diào)節(jié)AHSP在鐵過多狀態(tài)下的表達(dá)，加劇α-珠蛋白的不穩(wěn)定性，進(jìn)而加劇地貧的癥狀。機(jī)體內(nèi)（尤其是病理狀態(tài)下）是否存在其他正調(diào)節(jié)AHSP的因素，可以通過促進(jìn)AHSP的表達(dá)而穩(wěn)定游離的α-珠

6、蛋白呢？我們在AHSP啟動子區(qū)預(yù)測到小Maf家族成員的識別位點(diǎn)，因此推測CNC-bZIP家族成員NF-E2p45和Nrf2可能調(diào)節(jié)AHSP的表達(dá)。
　　 CNC-bZIP蛋白家族的成員眾多，包括NF-E2，Nrf1，Nrf2，Nrf3，Bach1和Bach2等，均可以與小Maf家族蛋白形成二聚體。其中，NF-E2與GATA-1、EKLF等同為調(diào)節(jié)紅系正常生成的重要轉(zhuǎn)錄因子，對紅系分化晚期的珠蛋白基因的表達(dá)調(diào)節(jié)至關(guān)重要。而Nrf2

7、主要在細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)及抵抗炎癥等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，可以調(diào)節(jié)大量參與細(xì)胞保護(hù)的基因。
　　 我們首先檢測了AHSP在14.5天胎鼠的不同組織中的表達(dá)情況以及在紅系不同分化階段的表達(dá)情況。我們以Hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞模擬紅系分化早期階段，以DMSO誘導(dǎo)的MEL細(xì)胞模擬紅系分化的晚期階段。結(jié)果表明，AHSP在胚胎期的表達(dá)主要集中在紅系發(fā)生的特異組織胎肝，并且在細(xì)胞系中AHSP與α-珠蛋白的表達(dá)均隨著紅系分化程度的增加而升

8、高。在我們的實(shí)驗(yàn)體系里證明了AHSP作為紅系特異蛋白的表達(dá)特點(diǎn)。
　　 我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)考察NF-E2p45和Nrf2對AHSP的調(diào)節(jié)作用。首先通過在MEL細(xì)胞亞型DS19細(xì)胞中干擾Mafk的方法檢測其對AHSP的影響。在Mafk干擾的情況下AHSP的表達(dá)顯著升高。提示我們Mafk的確可以調(diào)控AHSP的表達(dá)，但在細(xì)胞未被誘導(dǎo)情況下，Mafk募集轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，起抑制AHSP表達(dá)的作用。然后我們分別考察NF-E2p45和Nr2

9、對AHSP的調(diào)節(jié)作用。過表達(dá)和干擾NF-E2p45可以引起AHSP表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)，說明NF-E2p45對AHSP存在正向調(diào)節(jié)作用；熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和ChIP證明NF-E2p45可以通過直接與AHSP調(diào)控區(qū)結(jié)合而在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)其表達(dá)。Nrf2與NF-E2p45得到相似的結(jié)論。以Nrf2特異性激活劑tBHQ和DEM處理K562細(xì)胞后，AHSP的表達(dá)顯著上調(diào)；過表達(dá)和干擾Nrf2后AHSP相應(yīng)地上調(diào)和下調(diào)；熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和ChIP進(jìn)一步證

10、明了Nrf2對AHSP的正向調(diào)節(jié)作用是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平的。
　　 新的調(diào)節(jié)機(jī)制在怎樣的細(xì)胞狀態(tài)下發(fā)揮調(diào)控功能呢？我們通過在人慢性髓白血病K562細(xì)胞系中篩選過表達(dá)α-珠蛋白的穩(wěn)定混合克隆株構(gòu)建了模擬β-地中海貧血的細(xì)胞模型。首先通過WB的方法檢測α-珠蛋白的表達(dá)情況，證明我們成功得到了過表達(dá)的穩(wěn)定株。然后，細(xì)胞經(jīng)DCFH-DA探針標(biāo)記后通過流式細(xì)胞儀檢測ROS的釋放情況。由于α-珠蛋白更傾向以不穩(wěn)定的單體形式存在，而β-珠蛋白可以

11、自身形成相對穩(wěn)定的二聚體或者四聚體，所以一般情況下游離的α-珠蛋白產(chǎn)生的ROS更多，β-地貧的癥狀也更嚴(yán)重。我們的分析結(jié)果也顯示，過表達(dá)α-珠蛋白的細(xì)胞株比過表達(dá)β-珠蛋白以及過表達(dá)空載體的細(xì)胞株釋放更多的ROS，與預(yù)期結(jié)果一致，說明我們構(gòu)建的模型可以模擬β-地貧狀態(tài)。文獻(xiàn)報(bào)道表明Nrf2可以被ROS激活而調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，因此我們進(jìn)一步檢測了細(xì)胞模型中Nrf2的激活情況和AHSP的表達(dá)情況。免疫熒光結(jié)果表明，過表達(dá)α-珠蛋白的K5

12、62穩(wěn)定株和過表達(dá)β-珠蛋白的K562穩(wěn)定株中的Nrf2都發(fā)生入核現(xiàn)象。同時(shí)檢測的Nrf2的蛋白水平也顯示，過表達(dá)α-珠蛋白的細(xì)胞株中Nrf2的表達(dá)水平與β-珠蛋白和空載體組相比最高。而在正常情況下胞漿中的Nrf2半衰期很短，與Keapl結(jié)合促使其很快經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解。Nrf2入核及可經(jīng)WB檢測到蛋白水平都可以使我們得出結(jié)論，細(xì)胞模型中的Nrf2被過表達(dá)α-珠蛋白產(chǎn)生的ROS激活了。此時(shí)分析發(fā)現(xiàn)，地貧細(xì)胞模型中AHSP的表達(dá)在蛋

13、白水平和RNA水平也都被上調(diào)了。為了證明AHSP的表達(dá)升高的確是由Nrf2引起的，我們進(jìn)一步干擾了細(xì)胞模型中Nrf2的表達(dá)，Nrf2干擾造成地貧細(xì)胞模型中AHSP的表達(dá)不再上調(diào)，說明Nrf2是游離α-珠蛋白調(diào)節(jié)AHSP的關(guān)鍵蛋白。而此時(shí)檢測NF-E2p45的表達(dá)并未發(fā)生改變，可以部分說明NF-E2p45在這個(gè)過程中沒有發(fā)揮主要作用。結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道，我們的結(jié)果表明，在β-地貧狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)存在一個(gè)保護(hù)性的反饋環(huán)路：游離的α-珠蛋白通過釋

14、放ROS激活Nrf2信號通路，Nrf2引起AHSP的上調(diào)，AHSP表達(dá)升高后可以穩(wěn)定游離的α-珠蛋白本身。
　　 雖然內(nèi)在反饋環(huán)路的存在可以相對降低地貧的發(fā)生幾率或者相對緩解地貧的癥狀，但是當(dāng)機(jī)體已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重地貧表型時(shí)，僅有內(nèi)在的反饋環(huán)路是顯然不夠的，我們還需要利用外在手段通過給藥等途徑治療地貧。Nrf2特異性激活劑tBHQ是一種強(qiáng)抗氧化劑，已有報(bào)道表明抗氧劑可以在細(xì)胞水平緩解紅細(xì)胞的氧化狀態(tài)，那么，tBHQ是否可以用于地貧的治

15、療呢？我們的結(jié)果表明tBHQ不僅在細(xì)胞水平，還可以在動物水平升高AHSP的表達(dá)，從而增強(qiáng)其對α-珠蛋白的穩(wěn)定作用，并且在地貧細(xì)胞模型中tBHQ處理可引起AHSP的表達(dá)在內(nèi)源性反饋增加的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高。提示了tBHQ作為潛在的治療地貧藥物的可能性。
　　 綜上所述，我們的結(jié)果首次證明了NF-E2p45和Nrf2對AHSP的調(diào)節(jié)作用；第一次提出并證明了地貧狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)存在內(nèi)在的保護(hù)性反饋環(huán)路；并提示抗氧化劑tBHQ可以通過上調(diào)AH