應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制豬圓環(huán)病毒2型的復(fù)制和表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白的桿狀病毒的免疫保護(hù)作用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科，為單股環(huán)狀 DNA病毒。分為I型(poreine circovirus type 1，PCVl)和2型(porcinecircovirus type 2，PCV2)，其中PCV1不致病，PCV2具有致病性，能引起豬的多種病癥，如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、豬皮炎與腎病

2、綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)及繁殖障礙等。自加拿大1991年首次報(bào)道發(fā)生PMWS以來，現(xiàn)在全世界大多數(shù)養(yǎng)豬國家均有該病發(fā)生。PCV2感染能造成免疫抑制，易繼發(fā)或并發(fā)其它病原體感染，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。 因此，尋找一些新的方法防制該病已成為一項(xiàng)緊迫任務(wù)。對(duì)該病的防制，一方面在于研制新型疫苗，如DNA疫苗和亞單位苗；另一方面，一些新技術(shù)的應(yīng)用，如

3、RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)。RNA干擾是近年來發(fā)展起來的一種新技術(shù)，可通過對(duì)特定基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA進(jìn)行降解，對(duì)病原體的復(fù)制產(chǎn)生抑制，從而防止疾病的發(fā)生。本研究首先從臨床上疑為PMWS的病例中分離到了10株P(guān)CV2，測(cè)定其全基因組序列，并對(duì)基因序列進(jìn)行了遺傳分析，獲得了基因組的變異信息。對(duì)一株P(guān)CV2參考毒株的開放閱讀框2進(jìn)行了克隆，鑒定后構(gòu)建了表達(dá)PCV2衣殼蛋白(capsid，Cap)的重組桿狀病毒

4、，對(duì)其表達(dá)的Cap蛋白進(jìn)行了免疫生物學(xué)特性研究，同時(shí)進(jìn)行了桿狀病毒表達(dá)的Cap蛋白對(duì)小鼠的免疫保護(hù)試驗(yàn)。對(duì)測(cè)定的和網(wǎng)上登錄的PCV基因組序列進(jìn)行了同源性分析，應(yīng)用相關(guān)軟件和網(wǎng)上資源設(shè)計(jì)了6個(gè)PCV特異性小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)片段，構(gòu)建了siRNA表達(dá)質(zhì)粒，鑒定出了相應(yīng)的插入序列正確的克隆，對(duì)PCV1和PCV2毒株在Dulac細(xì)胞及PCV2毒株在小鼠體內(nèi)復(fù)制的抑制作用進(jìn)行了初步研究。

5、 1.江蘇部分地區(qū)10株豬圓環(huán)病毒2型分離株的分子流行病學(xué)從PMWS病例中分離到1O株P(guān)CV2，對(duì)其全基因組序列進(jìn)行了測(cè)定和分析，并將10株P(guān)CV2毒株基因組序列提交到GenBank。分析結(jié)果表明，分離到的10株P(guān)CV2全長(zhǎng)均為1767個(gè)核苷酸，分屬于3個(gè)不同的基因亞群，其中蘇州0511毒株在一個(gè)較遠(yuǎn)的分支上，揚(yáng)州0705與其它8個(gè)毒株分布在不同分支上，遺傳上有一定差異，但總體上遺傳關(guān)系較近，基因組同源性在98.3-99.5％之間

6、，同處于PCV2基因1群中。其中一株分離自家養(yǎng)野豬的PCV2和其它7株遺傳關(guān)系非常近，可能是同一個(gè)起源。這些分離株的cap基因變異程度不大，可作為亞單位苗或DNA疫苗的良好候選基因。 2.表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白的重組桿狀病毒對(duì)小鼠的免疫保護(hù)作用通過PCR方法擴(kuò)增出PCV2 XSC株cap基因，克隆到pGEM-T(R) easy載體，測(cè)序驗(yàn)證后亞克隆到轉(zhuǎn)座載體pFastBacTM1，經(jīng)再次測(cè)序驗(yàn)證后將含有PCV2衣殼蛋白基因的

7、表達(dá)盒轉(zhuǎn)座到穿梭載體Bacmid中。將獲得的重組質(zhì)粒Bacmid-Cap轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得了重組桿狀病毒，病毒擴(kuò)增后重組桿狀病毒的滴度達(dá)到5×108pfu／ml，以103pfu的reBac-Cap感染Sf9細(xì)胞，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot證實(shí)Cap蛋白已表達(dá)，分子量約28 kDa，與天然衣殼蛋白分子量大小一致。SDS-PAGE證實(shí)，PCV2 Cap蛋白非分泌性、可溶性地表達(dá)于Sf9細(xì)胞胞漿內(nèi)。取感染reBac-Cap

8、的Sf9細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)，能與豬抗PCV2高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)，顯示重組核衣殼蛋白具有良好的抗原性。重組桿狀病毒免疫小鼠，應(yīng)用間接免疫熒光方法對(duì)接種后7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d的小鼠進(jìn)行血清抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示從接種后21d開始小鼠血清產(chǎn)生了針對(duì)PCV2 Cap蛋白的特異性抗體，攻毒后不同時(shí)間應(yīng)用建立的TaqMan探針定量PCR方法檢測(cè)血清中PCV2病毒拷貝數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)PCV2 Cap的重組桿狀

9、病毒免疫后對(duì)病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制具有一定的抑制作用。 3.質(zhì)粒表達(dá)的siRNA片段對(duì)豬圓環(huán)病毒在Dulac細(xì)胞中復(fù)制的抑制作用在對(duì)PCV2基因組進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了siRNA片段，合成后構(gòu)建了表達(dá)載體。對(duì)GenBank中登錄和實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的PCV基因組序列進(jìn)行分析，將PCV毒株基因保守區(qū)序列提交到Ambion公司提供的siRNA查找工具，產(chǎn)生候選siRNA片段，將候選siRNA片段在internet上進(jìn)行同源比對(duì)，將與其它物種同

10、源性高的siRNA片段剔除。結(jié)合已發(fā)表文獻(xiàn)中的siRNA片段序列，最終確定了6個(gè)siRNA片段，其中4個(gè)是針對(duì)豬圓環(huán)病毒rep基因的，命名為SH1(S50-68)、SH2(S554-572)、SH3(S653-671)、SH4(S624-642)；2個(gè)針對(duì)PCV2 cap基因，命名為SH5(R1429-1411)、SH6(R1307-1289)。根據(jù)所用表達(dá)載體RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen的要求設(shè)計(jì)了

11、6對(duì)67個(gè)堿基的DNA片段，該序列可在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(short hairpin RNA，shRNA)分子。人工合成相應(yīng)DNA片段，退火后形成雙鏈，與載體試劑盒中的針對(duì)螢光素酶(Luciferase，Luc)的67個(gè)堿基的siRNA相應(yīng)DNA片段及陰性對(duì)照片段(46個(gè)堿基)分別連接到載體鼠源U6啟動(dòng)子下游，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，測(cè)序鑒定，得到了正確的克隆，分別命名為Retro-SH1、Retro-SH2、Re

12、tro-SH3、Retro-SH4、Retro-SH5、Retro-SH6、Retro-Lue和Retro-NC。 首先對(duì)siRNA表達(dá)質(zhì)粒Retro-SH1、Retro-SH2、Retro-SH3、Retro-SH4、Retro-SH5、Retro-SH6的抑制作用進(jìn)行檢測(cè)，篩選出抑制作用較強(qiáng)的siRNA。重懸后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Dulac細(xì)胞0.5ml／孔(2.0x105個(gè)細(xì)胞)置于24孔細(xì)胞板中進(jìn)行培養(yǎng)，6 h后加入梭華-Sof

13、astTM基因轉(zhuǎn)染試劑及0.6μg的siRNA表達(dá)質(zhì)粒Retro-SH1、Retro-SH2、Retro-SH3、Retro-SH4、Retro-SH5、Retro-SH6、Retro-Luc和對(duì)照質(zhì)粒復(fù)合物，12 h、24 h后分別進(jìn)行熒光觀察。24 h后每孔加入0.1ml含有105TCID50的PCV2 XSC株病毒液感染上述細(xì)胞，感染后72 h收集上清和細(xì)胞，應(yīng)用TaqMan探針Real-time PCR法對(duì)PCV2病毒拷貝數(shù)進(jìn)行

14、檢測(cè)。 對(duì)不同濃度的質(zhì)粒產(chǎn)生的干擾作用進(jìn)行了比較，轉(zhuǎn)染50 ng、100 ng，500ng、1000 ng、1500 ng、2500 ng表達(dá)siRNA質(zhì)粒的Dulac細(xì)胞在感染PCV2后60 h收集上清和細(xì)胞，檢測(cè)其病毒在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)不同濃度的表達(dá)質(zhì)粒對(duì)PCV2 XSC株的復(fù)制均有抑制作用，且500ng-2500ng濃度的質(zhì)粒其干擾作用無明顯差別。綜合考慮質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞的干擾強(qiáng)度相當(dāng)且節(jié)省質(zhì)粒等原則，隨后在細(xì)胞中的抑制試驗(yàn)

15、均選用500 ng的質(zhì)粒。 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)500 ng的Retro-SH1，Retro-SH4，Retro-SH6表達(dá)的siRNA片段對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用進(jìn)行了分析，結(jié)果表明三個(gè)質(zhì)粒表達(dá)的siRNA對(duì)PCV2的復(fù)制均有一定的抑制作用，其中Retro-SH4作用最強(qiáng)。 4.表達(dá)siRNA的質(zhì)粒對(duì)PCV2在小鼠體內(nèi)復(fù)制的抑制作用將72只8周齡BALB／c小鼠隨機(jī)分為12組，每組6只，第1-4組每只分別肌肉注射10 μg表達(dá)

16、的siRNA質(zhì)粒Retro-SH1，Retro-SH4，Retro-SH6，Retro-NC，第5組肌肉注射10μg Retro-SH1，Retro-SH4和Retro-SH6混合質(zhì)粒。24 h后每只按105TCID50的量口服及腹腔注射0.1ml的PCV2病毒。第6-10組先用105TCID50 PCV2攻毒，24 h后每只分別肌肉注射10μg表達(dá)的siRNA質(zhì)粒Retro-SH1，Retro-SH4，Retro-SH6或它們的混合體

17、及Retro-NC。第11組為攻毒對(duì)照組，第12組為健康對(duì)照組。分別于感染后第5天及第11天進(jìn)行撲殺采樣，每次采集3只小鼠血清和脾臟，應(yīng)用real-time PCR方法檢測(cè)血清中PCV2病毒拷貝數(shù)，通過免疫組化和組織學(xué)方法檢測(cè)組織中病毒抗原與病理損傷。結(jié)果表明10μg siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)PCV2攻毒的小鼠有很好的保護(hù)力，但不同的siRNA分子保護(hù)力有差異。3個(gè)siRNA表達(dá)質(zhì)?；旌象w與單獨(dú)作用最強(qiáng)的質(zhì)粒組的保護(hù)力沒有明顯差異，并未顯示