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文檔簡介
1、目的:肝纖維化(Hepaticfibrosis,HF)是指由于各種致病因子造成肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生,從而引起肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(Extra-cellularmatrix,ECM)過度沉積的病理過程,是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段。因此,及時(shí)阻斷及逆轉(zhuǎn)肝纖維化是防止肝硬化發(fā)生、改善肝臟疾病預(yù)后的關(guān)鍵。多種細(xì)胞因子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程,其中轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowthfactorbeta
2、,TGF-β)是一類能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及細(xì)胞分化的多肽,是介導(dǎo)肝纖維化最關(guān)鍵的細(xì)胞因子,能夠激活肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecells,HSC),活化的HSC進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA),合成并分泌ECM。TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)途徑是肝纖維化最重要的調(diào)控機(jī)制之一,對于肝纖維化的形成意義重大。目前已對肝纖維化的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了大量研究,但阻斷肝纖維化發(fā)生發(fā)展仍是需要攻克的難題。近年來中醫(yī)
3、理論研究及臨床實(shí)踐證明,中醫(yī)藥防治肝纖維化有獨(dú)特的效果,其優(yōu)勢在于多靶點(diǎn)、多途徑的整合治療作用?;鐾ńj(luò)中藥鱉甲煎丸為東漢醫(yī)家張仲景所創(chuàng),載于《金匱要略·瘧病脈證并治》,是治療“瘧母”的主方,具有活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)、益氣健脾的特點(diǎn)。鱉甲煎丸用于治療肝纖維化、肝硬化,療效確切,其成藥廣泛用于臨床,療效顯著。本研究擬采用鱉甲煎丸作用于CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型,通過觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況,檢測血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT
4、)、血清白蛋白(ALB)的含量,測定Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ)、層粘連蛋白(LN)水平,觀察肝臟病理學(xué)形態(tài)變化,檢測肝組織TGF-β1及Smad3mRNA水平及各組大鼠肝組織α-SMA蛋白表達(dá),探討化瘀通絡(luò)中藥抗肝纖維化療效及其可能作用機(jī)制。
方法:健康清潔級(jí)雄性SD大鼠56只,體重360-410g,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為6組:正常組(A組)、模型組(B組)、秋水仙堿組(C組,0.1mg/(kg.d))、鱉甲煎丸低劑量組(
5、D組,0.55g/(kg.d))、鱉甲煎丸中劑量組(E組,1.1g/(kg.d))、鱉甲煎丸高劑量組(F組,2.2g/(kg.d))。除正常組皮下注射橄欖油外,其它各組大鼠皮下注射40%CCl4橄欖油溶液,首次皮下注射5ml/kg體重,以后每周皮下注射2次,每次注射量均為3ml/kg體重,誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型。秋水仙堿組及鱉甲煎丸低、中、高劑量組在造模同時(shí)予以10ml/(kg.d)相應(yīng)藥液灌胃治療,正常組和模型組同時(shí)給予等劑量的蒸餾水灌
6、胃處理。于實(shí)驗(yàn)第6周造模成功后,停止CCl4或橄欖油皮下注射。秋水仙堿組、鱉甲煎丸低、中、高劑量組分別繼續(xù)給予原劑量藥液灌胃,正常組、模型組繼續(xù)給予蒸餾水灌胃,每日一次,連續(xù)5周。于實(shí)驗(yàn)第11周末,大鼠禁食12h,應(yīng)用水合氯醛麻醉,心臟穿刺取血,離心分離血清,測定各組大鼠血清ALT、AST、ALB水平,放射免疫法檢測血清Col-Ⅳ、LN水平;取大鼠肝臟,留取肝左葉,置于4%多聚甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋,Masson染色及HE染色,光
7、鏡下觀察肝組織的病理形態(tài)學(xué)變化,免疫組化方法檢測肝組織中α-SMA蛋白表達(dá);將肝右葉組織迅速置于液氮中,速凍后取出凍存于-80℃冰箱內(nèi)保存,用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreactionRT-PCR)法檢測肝組織中TGF-β1及Smad3mRNA水平。
結(jié)果:
1大鼠一般情況
正常組大鼠營養(yǎng)狀況良好,體重自然增加,體態(tài)正常,反應(yīng)靈
8、敏,皮毛密集而有光澤。其他各組大鼠一般情況差,飲食少,毛發(fā)暗淡,體形消瘦,反應(yīng)遲鈍,脾氣煩躁易激惹。在試驗(yàn)過程中,模型組死亡2只大鼠,秋水仙堿組、鱉甲煎丸低、中、高劑量組各死亡1只大鼠。
2各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織病理變化
光鏡下觀察:正常組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整,匯管區(qū)和中央靜脈未見結(jié)締組織增生,肝細(xì)胞多為單核,核仁清晰,未見脂肪變性和壞死,肝細(xì)胞呈條索狀排列,向周圍放射。模型組正常的肝小葉結(jié)構(gòu)破壞或消失,肝組
9、織廣泛脂肪變性、壞死,呈空網(wǎng)狀,匯管區(qū)擴(kuò)大及炎性細(xì)胞浸潤,纖維結(jié)締組織增生明顯,形成厚薄不一且相連接的纖維間隔,出現(xiàn)明顯的肝纖維化。與模型組相比,鱉甲煎丸各劑量組及秋水仙堿組肝小葉破壞明顯減輕,肝細(xì)胞脂肪變性壞死減少,炎性細(xì)胞浸潤較少,可見纖維組織輕度增生,形成細(xì)薄的纖維束,假小葉形成明顯減少。鱉甲煎丸高劑量組與中、低劑量組及秋水仙堿組相比肝纖維化程度明顯減輕,秋水仙堿組與鱉甲煎丸低劑量組相比,肝臟病理改變差別不明顯。
3
10、各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清ALT、AST及ALB含量比較
各組大鼠血清ALT、AST含量結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組、秋水仙堿組、鱉甲煎丸各劑量組明顯升高(P<0.05);與模型組相比,秋水仙堿組、鱉甲煎丸各劑量組明顯降低(P<0.05);與秋水仙堿組相比,鱉甲煎丸高劑量組較之明顯減低(P<0.05),低劑量組較之升高(P<0.05),中劑量組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);鱉甲煎丸各劑量組之間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0
11、.05):高劑量組最低,低劑量組最高,中劑量組居中。
各組大鼠血清ALB含量的結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組、秋水仙堿組、鱉甲煎丸各劑量組明顯降低(P<0.05);與模型組相比,秋水仙堿組、鱉甲煎丸中、高劑量組明顯升高(P<0.05),低劑量組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與秋水仙堿組相比,鱉甲煎丸高劑量組較之明顯升高(P<0.05),低劑量組較之明顯降低(P<0.05),中劑量組與之相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.
12、05);鱉甲煎丸各劑量組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05):高劑量組最高,低劑量組最低,中劑量組居中。
4各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清Col-Ⅳ、LN水平
各組大鼠血清Col-Ⅳ水平顯示:與正常組相比,模型組、秋水仙堿組、鱉甲煎丸各劑量組明顯升高(P<0.05);與模型組相比,秋水仙堿組、鱉甲煎丸中、高劑量組明顯降低(P<0.05),低劑量組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與秋水仙堿組相比,鱉甲煎丸高劑量組較
13、之明顯降低(P<0.05),低劑量組較之明顯升高(P<0.05),中劑量組與之相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);鱉甲煎丸各劑量組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05):高劑量組最低,低劑量組最高,中劑量組居中。
各組大鼠血清LN水平顯示:與正常組相比,模型組、秋水仙堿組、鱉甲煎丸各劑量組明顯升高(P<0.05);與模型組相比,秋水仙堿組、鱉甲煎丸各劑量組明顯降低(P<0.05);與秋水仙堿組相比,鱉甲煎丸高劑量組較之
14、明顯減低(P<0.05),低劑量組較之升高(P<0.05),中劑量組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);鱉甲煎丸各劑量組之間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05):高劑量組最低,低劑量組最高,中劑量組居中。
5各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟組織TGF-β1及Smad3mRNA表達(dá)水平
各組大鼠肝臟組織TGF-β1mRNA水平:與正常組相比,模型組、秋水仙堿及鱉甲煎丸各劑量組表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組相比,秋水
15、仙堿及鱉甲煎丸各劑量組降低(P<0.05);與秋水仙堿組相比,鱉甲煎丸高劑量組較之降低(P<0.05),低劑量組較之升高(P<0.05),中劑量組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);鱉甲煎丸各劑量組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05):高劑量組最低,低劑量組最高,中劑量組居中。
各組大鼠肝臟組織Smad3mRNA水平:與正常組相比,模型組、秋水仙堿及鱉甲煎丸各劑量組表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組相比,秋水仙堿及
16、鱉甲煎丸各劑量組降低(P<0.05);與秋水仙堿組相比,鱉甲煎丸高劑量組較之降低(P<0.05),低劑量組較之升高(P<0.05),中劑量組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);鱉甲煎丸各劑量組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05):高劑量組最低,低劑量組最高,中劑量組居中。
6各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織α-SMA蛋白表達(dá)
正常組大鼠肝組織中α-SMA只表達(dá)于小動(dòng)脈及小靜脈,在膽管無表達(dá)。模型組表達(dá)明顯增多、增強(qiáng),陽
17、性染色程度增加,主要見于匯管區(qū)及纖維間隔,呈長橢圓形或梭形。其余秋水仙堿組、鱉甲煎丸各劑量組陽性染色程度較模型組明顯減輕(P<0.05),纖維隔內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞及炎性細(xì)胞陽性染色不同程度減輕,鱉甲煎丸高劑量組陽性染色明顯低于劑量組、中劑量組及秋水仙堿組(P<0.05),秋水仙堿組與鱉甲煎丸中劑量組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
結(jié)論:
1肝纖維化大鼠存在肝功能損傷、肝內(nèi)纖維結(jié)締組織增生及細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積,
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