以gbss、ssⅢ和ssⅡ?yàn)榘袠?biāo)的RNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的獲得.pdf

1、馬鈴薯(Solanum tuberosum L)是淀粉生產(chǎn)的重要原料，其淀粉具有優(yōu)良的特性，廣泛應(yīng)用于工業(yè)、食品及化工行業(yè)。但在大多數(shù)應(yīng)用領(lǐng)域中，一般要求淀粉具有較低的糊化溫度和較弱的凝沉性，因而淀粉的糊化和凝沉(老化)特性成為其應(yīng)用的重要參考指標(biāo)，而這兩種性質(zhì)主要與直鏈淀粉與支鏈淀粉比例、淀粉鏈長以及淀粉的結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此，培育具有較低糊化溫度和優(yōu)良凝沉特性的品種，對(duì)于提高馬鈴薯淀粉的應(yīng)用范圍和促進(jìn)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。 隨

2、著人們對(duì)淀粉生物合成途徑相關(guān)酶生化代謝途徑及分子機(jī)理研究的不斷深入，使得應(yīng)用基因工程技術(shù)調(diào)控淀粉合成過程中相關(guān)酶基因的表達(dá)，從而使得降低淀粉糊化溫度和提高凍融穩(wěn)定性成為可能。為此，本研究開展了以RNAi技術(shù)對(duì)馬鈴薯塊莖內(nèi)源gbss、ssⅢ和ssⅡ基因進(jìn)行同時(shí)干擾，期望通過改變淀粉合成相關(guān)酶的活性，進(jìn)而改變塊莖中積累的淀粉分子組成，獲得糊化溫度低且凍融穩(wěn)定性更好的加工型馬鈴薯品種。經(jīng)過研究，已取得了如下結(jié)果： (1)應(yīng)用blast

3、及分子生物學(xué)軟件DNAstar對(duì)gbss、ssⅡ和ssⅢ基因的cDNA序列同源性進(jìn)行分析比較，分別從gbss、ssⅢ和ssⅡ基因cDNA片段ORF中篩選出了1～261、2 164～2 407、161～441之間的序列片段作為靶標(biāo)；采用一步PCR法將靶標(biāo)基因片段進(jìn)行融合，得到了大小為785 bp的gbss、ssⅡ和ssⅢ三個(gè)基因片段的融合基因。 (2)為便于構(gòu)建RNAi載體，分別以LS-8質(zhì)粒(含gbss基因5′側(cè)翼序列)、LS-

4、4質(zhì)粒(含patatin啟動(dòng)子序列)為模板，亞克隆了馬鈴薯塊莖顆粒結(jié)合型淀粉合成酶gbss基因5′側(cè)翼序列及馬鈴薯patatin啟動(dòng)子，并在這兩個(gè)啟動(dòng)子5′和3′加入了Sac Ⅰ和Xho Ⅰ限制性酶切位點(diǎn)。 (3)分別構(gòu)建了以gbss基因5′側(cè)翼序列和patatin組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的含有“正向gbs3s2融合片段-pdk內(nèi)含子-反向gbs3s2融合片段”的植物表達(dá)載體pART-GF、pART-PF，并將其成功導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌L

5、BA4404。 (4)選用馬鈴薯“NHD3”、“NF”和“NC”的莖段作為外植體材料，在MS培養(yǎng)基基本成分的基礎(chǔ)上，對(duì)生長激素的濃度和配比進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出有利于受體材料高效再生的培養(yǎng)基配方，其中有利于莖段愈傷誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為：MS0+1.0 mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA(NHD3)；MS0+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA(NC)；MS0+1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/NAA(NF)。初