玉米ZmCKX1和ZmCKX5基因RNAi轉(zhuǎn)基因株系的表型分析及CRISPR-Cas9靶向編輯載體的構(gòu)建.pdf

1、細(xì)胞分裂素（Cytokinin，CK）是植物生長和發(fā)育過程的主要調(diào)節(jié)因子，是影響植物生理活動(dòng)最廣的基本必須激素，其作用包括細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、營養(yǎng)信號、種子和果實(shí)發(fā)育、頂端優(yōu)勢、葉片衰老和相應(yīng)環(huán)境脅迫等。植物體內(nèi)細(xì)胞分裂素的動(dòng)態(tài)平衡主要通過異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（Isopentenyl transferases，IPT）的催化合成和細(xì)胞分裂素氧化酶（Cytokinin oxidase，CKX）的不可逆降解來實(shí)現(xiàn)。玉米細(xì)胞分裂素氧化酶的編碼基因C

2、KX是由13個(gè)成員組成的多基因家族，而且不同CKX家族成員在植物發(fā)育過程中表現(xiàn)出特定的時(shí)空表達(dá)模式，調(diào)節(jié)不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞分裂素水平。其中ZmCKX1和ZmCKX5基因分別在調(diào)控玉米籽大小和籽粒數(shù)目方面扮演著重要角色。
　　本研究首先以實(shí)驗(yàn)室前期獲得的ZmCKX1和ZmCKX5基因的多個(gè)RNAi轉(zhuǎn)基因玉米株系為材料，通過對內(nèi)源ZmCKX1和ZmCKX5基因在授粉后籽粒時(shí)期的表達(dá)量變化以及植株和穗粒表型性狀的分析，驗(yàn)證了Z

3、mCKX1和ZmCKX5基因在調(diào)控玉米生長發(fā)育及籽粒產(chǎn)量方面的功能。然后通過克隆玉米ZmU3啟動(dòng)子并改造sgRNA基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，構(gòu)建了玉米ZmCKX1和ZmCKX5基因的CRISPR/Cas9靶向編輯載體系統(tǒng)。并在對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米莖尖轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，以玉米自交系鄭58為轉(zhuǎn)化的受體對所構(gòu)建的編輯載體進(jìn)行了預(yù)轉(zhuǎn)化。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）玉米RNAi沉默ZmCKX1和ZmCKX5基因表達(dá)譜的分析
　　分別對

4、玉米ZmCKX1和ZmCKX5基因的各6個(gè)沉默表達(dá)株系進(jìn)行了qPCR分析，比較ZmCKX1和ZmCKX5基因的表達(dá)特性。結(jié)果表明，與野生型玉米相比，玉米ZmCKX1和ZmCKX5基因沉默轉(zhuǎn)基因株系在授粉后時(shí)期的籽粒中呈現(xiàn)出表達(dá)量的明顯下調(diào)。
　　（2）RNAi沉默ZmCKX1和ZmCKX5基因?qū)τ衩咨L發(fā)育和產(chǎn)量的影響
　　分別對玉米ZmCKX1和ZmCKX5基因的各6個(gè)沉默表達(dá)株系進(jìn)行植株性狀與穗粒性狀的調(diào)查，與野生型WT

5、相比，T3代純合的ZmCKX1和ZmCKX5基因RNAi抑制株系均呈現(xiàn)差異顯著性；在植株性狀方面，株高、穗位高和穗位葉長均呈現(xiàn)明顯增大趨勢；在產(chǎn)量性狀方面，穗長顯著增加，穗粗顯著減小，單穗行粒數(shù)與總粒數(shù)顯著增加，50粒重顯著增加，穗?？傊匾渤尸F(xiàn)顯著增加的趨勢。表明沉默ZmCKX1和ZmCKX5基因的轉(zhuǎn)基因玉米表現(xiàn)出對生長發(fā)育的籽粒產(chǎn)量名顯促進(jìn)作用。
　?。?）玉米ZmCKX1和ZmCKX5基因的CRISPR/Cas9靶向編輯系統(tǒng)的

6、構(gòu)建
　　本研究通過對玉米ZmU3啟動(dòng)子的克隆，構(gòu)建了適用于在玉米中表達(dá)sgRNA的CRISPR/Cas9系統(tǒng)載體，通過置換Cas9基因的表達(dá)載體骨架，構(gòu)建了具有BASTA抗性的CRISPR/Cas9載體，二者構(gòu)成適用于玉米莖尖轉(zhuǎn)化的基因編輯載體系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了玉米ZmCKX1和ZmCKX5基因的CRISPR/Cas9靶向編輯載體各5個(gè)。
　　（4）玉米莖尖轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)化研究
　　利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米莖尖轉(zhuǎn)化技