CHB患者CD4+CD25+Treg TCRCDR3譜系漂移特征初步探討.pdf

1、目的:1.探討慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B，CHB)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatorycells，Tregs)中T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)β鏈各家族互補(bǔ)決定區(qū)3(complementarity determining region3，CDR3)譜系特征。了解TCR

2、BV家族CDR3譜系克隆增生異常率（單/寡/偏峰譜型）;2.對(duì)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈顯著特征的CD4+CD25+TregTCR CDR3譜系家族（單峰譜型）進(jìn)行CDR3區(qū)基因測(cè)序，分析其氨基酸組成，了解CHB患者外周血優(yōu)勢(shì)增生的CD4+CD25+Tregs細(xì)胞是否具有相同的基序，試圖尋找到相同的CD4+CD25+Treg細(xì)胞克隆，從而為CHB患者的個(gè)體化免疫治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:1.采集2例正常人及8例CHB患者外周抗凝靜脈血各

3、10ml，病例樣本為遵義醫(yī)學(xué)院感染科住院患者，采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，磁珠分選法分選CD4+CD25+Tregs，流式鑒定其純度，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)TCRβ鏈24個(gè)可變區(qū)基因(TCR BV)家族設(shè)計(jì)相應(yīng)的上游引物，并在β鏈恒定區(qū)基因區(qū)(BC)設(shè)計(jì)一條共用的FAM熒光標(biāo)記下游引物及對(duì)照引物。PCR(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增出24個(gè)TCR BV家族包含完整CDR

4、3區(qū)的PCR產(chǎn)物，電泳鑒定目的片段，送上?；敌忻?xì)管電泳法;2.分析CHB患者CD4+CD25+Tregs TCR BV家族CDR3譜系特征，選出呈單峰譜型的TCR BV家族PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，DNA tools6.0等分子生物信息學(xué)軟件分析CDR3區(qū)的基因和氨基酸組成;3.采用Spearman's分析CHB患者外周血CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3克隆增生異常率與HBV-DNA載量、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（Alanine

5、 aminotransferase，ALT）、總膽紅素(Total bilirubin，TB)及凝血酶原活動(dòng)度(Prothrombin Activityprothrombin Time Activity, PTA)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:1.2例正常人外周血CD4+CD25+Tregs TCRβ鏈24個(gè)家族CDR3譜系圖大部分家族呈多峰譜型的高斯分布，其24個(gè)家族PCR產(chǎn)物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳時(shí)可發(fā)現(xiàn)一條模糊條帶。各家族的C

6、DR3表達(dá)頻率相近，表現(xiàn)出不同的CDR3多態(tài)性。2.8例CHB患者外周血Tregs TCRβ鏈24個(gè)家族CDR3譜系圖均呈現(xiàn)一個(gè)或者多個(gè)形態(tài)不一、數(shù)量不等的單峰、寡峰、偏峰，其中一些家族表達(dá)極低或缺失。瓊脂糖凝膠電泳圖上多數(shù)家族預(yù)測(cè)范圍大小處呈現(xiàn)一條模糊條帶，部分家族出現(xiàn)清晰條帶或無(wú)條帶。
　　 結(jié)論:1.正常人外周血CD4+CD25+Tregs TCR BV家族譜型呈多克隆性增生;CHB患者外周血CD4+CD25+Tregs多