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文檔簡介
1、目的:
慢性排斥反應是導致移植器官功能喪失的最主要原因[1-7]。過去的40年內(nèi),隨著免疫抑制劑的不斷發(fā)展及有效應用,在保障移植器官長期存活以及維護良好器官功能方面取得了巨大成功[8-12]。然而,由于藥物本身特性導致的各種毒性反應,如:胃腸道不良反應、糖尿病、各型感染以及腫瘤的發(fā)生,長期困擾臨床治療[13-17]。如何規(guī)避藥物毒性實現(xiàn)免疫抑制是當前移植免疫學中亟待解決的關(guān)鍵問題之一。
口服免疫耐受(oral tol
2、erance)是通過口服可溶性抗原,如食物抗原,腸道微生物等,可誘導機體對該種抗原蛋白形成無反應或低反應的免疫耐受狀態(tài)[18-21]。因其獨特的理念及低毒性使其目前備受關(guān)注[22-24]??诜庖吣褪軝C制目前尚不清楚,主流認為是口服抗原在腸道誘導了抗原特異性的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)[25-26],后者通過有效抑制效應T細胞的活化與增殖,實現(xiàn)對該抗原的系統(tǒng)免疫主動抑制反應,然而具體機
3、制有待進一步研究證實[27-30]。
外泌體(exosomes)是多種細胞分泌的一種囊泡結(jié)構(gòu),其通過呈遞表面抗原,激活多種細胞免疫因子,介導細胞免疫反應,在免疫監(jiān)視、免疫排斥反應中發(fā)揮著重要作用[31-37]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn):外源性給予CD4+CD25+Treg細胞可延長移植腎存活時間。通過口服抗原,獲取了特異性CD4+CD25+Treg源性外泌體,并初步探討了CD4+CD25+Treg源性外泌體在大鼠腎移植中的保護作用。
4、在前期實驗的基礎(chǔ)上,通過靜脈注射與口服抗原途徑,誘導免疫耐受,觀察兩種途徑獲取的CD4+CD25+Treg源性外泌體對大鼠移植腎存活的影響。通過體外淋巴細胞共培養(yǎng)、SDS-PAGE、WB實驗明確外泌體在排斥反應中起到的作用。
材料與方法:
1.抗原的制備:在相關(guān)網(wǎng)站用特定的檢索方式網(wǎng)站查詢到RDP58(humanleukocyte antigen HLA衍生肽的一種)肽氨基酸序列,首先合成RDP58肽段,然后合成RD
5、P58衍生肽段,交聯(lián)RDP58衍生肽與霍亂毒素,之后用高效液相色譜法純化、檢測交聯(lián)產(chǎn)物,即抗原。
2.選擇6-8周齡劉易斯大鼠作為受體,分別通過靜脈注射與口服制備好的抗原誘導免疫耐受,并誘導特異性CD4+CD25+Treg細胞產(chǎn)生,之后選擇6-8周齡挪威大鼠作為受體建立起大鼠腎移植模型,觀察受體大鼠的血肌酐,尿素氮以及移植腎的病理損害情況。
3.CD4+CD25+Treg細胞源外泌體的制備:選擇6-8周齡劉易斯大鼠作
6、為受體,分別通過靜脈注射與口服制備好的抗原,誘導特異性CD4+CD25+Treg細胞產(chǎn)生,收集腸系膜淋巴結(jié),通過流式細胞儀分選淋巴結(jié)中的CD4+CD25+Treg細胞并進行培養(yǎng)10天,收集其細胞的培養(yǎng)上清液,用差速離心法收集上清中的外泌體,并用電鏡觀察鑒定,后冰凍存于-80度冰箱備用。
4.外泌體對腎臟的保護作用觀察:建立大鼠腎移植模型,通過尾靜脈將制備好的外泌體注射入受體大鼠,觀察受體大鼠的血肌酐,尿素氮以及移植腎的病理損害
7、情況。
5.用SDS-PAGE,Western Blot法檢測外泌體與免疫抑制相關(guān)蛋白種類,以及不同途徑誘導的外泌體在對移植物保護的比較。
結(jié)果:
1.通過RDP58衍生肽與霍亂毒素交聯(lián)產(chǎn)物能有效誘導口服耐受產(chǎn)生。
2.通過SDP-PAGE和Western blot檢測發(fā)現(xiàn),CD4+CD25+Treg源外泌體攜帶有白介素-10、TGF-β等細胞因子,與其發(fā)揮免疫抑制作用有關(guān)。外泌體是CD4+CD2
8、5+Treg發(fā)揮遠端調(diào)控,抑制免疫排斥反應的重要機制之一。
3.口服RDP58-GC-CTB抗原產(chǎn)生的CD4+CD25+Treg源外泌體與靜脈注射抗原產(chǎn)生的CD4+CD25+Treg源外泌體都能對移植腎產(chǎn)生保護作用,但口服途徑產(chǎn)生的外泌體,對移植腎的保護功能更強,更加安全便捷。
結(jié)論:
RDP58-GC-CTB是一種良好的抗原,能有效誘導免疫耐受;CD4+CD25+Treg來源的外泌體攜帶的免疫抑制性蛋白,
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