CD4+CD25+Treg和內(nèi)毒素在重癥急性胰腺炎肝損傷大鼠中的作用及連翹對其影響.pdf

1、重癥急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，SAP)是一種嚴(yán)重危及生命的全身性疾病，易誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)（systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS）及多臟器功能障礙（multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS）。肝臟是胰腺血液回流的第一站，是SAP累及的最主要胰外器官之一，其損傷除受失控性炎癥反應(yīng)影響外，機(jī)體免疫功能紊亂可能也是導(dǎo)致SAP肝損傷

2、的主要原因之一，同時(shí)肝損傷也可能對SAP的病情發(fā)展產(chǎn)生重要影響。SAP肝損傷早期因腸道機(jī)械屏障和免疫屏障功能受損引起腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素(Endotoxin，ET)移位，激發(fā)先天性炎癥反應(yīng)和免疫功能紊亂是其引起SIRS甚至MODS的重要機(jī)制之一。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+regulationTcell，Treg)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有獨(dú)特負(fù)向免疫調(diào)控作用的T細(xì)胞亞群，組成性高表達(dá)IL-2受體α鏈(CD25)，被認(rèn)為在

3、抑制自身免疫性疾病的進(jìn)展、控制潛在有害的炎癥反應(yīng)及維持免疫穩(wěn)態(tài)等方面起關(guān)鍵性的作用。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3(Forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor)是Treg的特征性標(biāo)志之一。在感染狀態(tài)下，Treg最主要的功能就是調(diào)節(jié)有效控制病原體的T細(xì)胞和導(dǎo)致嚴(yán)重炎癥及組織破壞的過度T細(xì)胞反應(yīng)之間的平衡。近年研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中藥連翹(Forsythiasuspensa(Thunb.)vah1)具有抗內(nèi)毒素和免疫調(diào)節(jié)作用

4、，但其機(jī)制不甚明確，在SAP肝損傷中對免疫平衡的影響尚未見報(bào)道。本研究擬通過大鼠在體實(shí)驗(yàn)分析SAP肝損傷早期外周血ET和Treg的變化規(guī)律及其與肝損傷的關(guān)系，探討連翹對ET、Treg的影響，從而為闡明ET和Treg在SAP肝損傷早期免疫失衡中的作用奠定基礎(chǔ)，并為尋找SAP肝損傷有效治療方法提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論依據(jù)。
　　 第一章CD4+CD25+Treg和內(nèi)毒素在重癥急性胰腺炎肝損傷大鼠中的作用
　　 研究目的：觀察

5、SAP肝損傷早期大鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血ET和Treg的變化規(guī)律，探討其在SAP肝損傷中的作用及機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：60只Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(shamoperation，SO)(n=30)和SAP模型組(n=30)，SO組開腹手術(shù)后僅翻動(dòng)胰腺后關(guān)腹，SAP組:逆行性膽胰管注射5％?；悄懰徕c(SodiumTaurocholate，NaTc)(O.1ml/1OOg，0.1ml/min)復(fù)制SAP

6、模型。各組均于3，6，12h麻醉狀態(tài)下，嚴(yán)格無菌操作，腹主動(dòng)脈采血，留取胰腺、肝臟標(biāo)本待測。全自動(dòng)生化分析儀測定血清淀粉酶(AMY)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，放射免疫法測定血漿腫瘤壞死因子（TNF-α），鱟試劑法測血漿內(nèi)毒素含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Treg百分率，免疫組織化學(xué)法測肝臟Foxp3表達(dá)，HE染色觀察胰腺、肝臟病理變化并行病理學(xué)評(píng)分，并對以上指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。計(jì)量資料行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)軟

7、件SPSS16.0。
　　 主要結(jié)果與SO組(0.38±0.08，1.86±0.06)比較，SAP組大鼠3h外周血ET含量和Treg百分率開始增高(0.74±0.11,2.26±0.32)，隨造模時(shí)間延長逐漸升高，于12h達(dá)到高峰（0.85±0.11,2.80±0.35;P＜O.O1）;肝組織Foxp3表達(dá)變化基本與Treg同步;胰腺及肝臟各時(shí)間點(diǎn)病理學(xué)評(píng)分均顯著高于SO組(P＜O.01);AMY、ALT、TNF-α濃度逐漸升高

8、(P＜O.O1)。SAP組Treg與ET及肝臟病理學(xué)評(píng)分均呈正相關(guān)(P＜0.01)。
　　 第二章連翹對重癥急性胰腺炎肝損傷大鼠內(nèi)毒素及CD4+CD25+Treg的影響
　　 研究目的：觀察不同劑量連翹對SAP肝損傷12h后大鼠血漿ET和Treg水平的影響，探討連翹在SAP肝損傷大鼠模型中抗內(nèi)毒素作用及免疫調(diào)節(jié)作用及其可能機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：60只SD大鼠隨機(jī)分成A組（SO組），B組（SAP模型組），C、D、

9、E組分別為連翹低、中、高劑量組（AFS1、AFS2、AFS3組），F(xiàn)組為陽性對照多粘菌素B組(PloyB組)(n=lO)。C、D、E組在造模前7天開始每天一次灌胃給藥，劑量:AFS1.25g/kg.2.5g/kg、5g/kg，F(xiàn)組造模前7天每天一次腹腔注射給藥(PloyB3500U/ml，1.5ml/1OOg)。各組造模方法同第一章，于造模后12h無菌腹主動(dòng)脈采血，留取肝臟組織HE染色，自動(dòng)生化分析儀測ALT，鱟試劑法測各組血漿內(nèi)毒素，

10、流式細(xì)胞術(shù)測A、B、C、D、E各組Treg百分率。
　　 計(jì)量資料行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0。
　　 主要結(jié)果與SO組相比，SAP12h組ALT及ET水平顯著升高，肝臟病理評(píng)分明顯升高，Treg百分率顯著升高，AFS1、AFS2和AFS3組上述指標(biāo)顯著降低，呈劑量依賴關(guān)系，AFS3組與PloyB組ET水平無顯著差異。
　　 結(jié)論
　　 1、應(yīng)用5％牛磺膽酸鈉

11、逆行性胰膽管注射制備SAP肝損傷模型，病理學(xué)檢測證實(shí):胰腺及肝臟出現(xiàn)不同程度水腫、出血、壞死及炎細(xì)胞浸潤，模型穩(wěn)定，可重復(fù)性好。
　　 2、肝臟病理性損傷及肝功能障礙隨SAP進(jìn)展逐漸加重，說明SAP時(shí)可并發(fā)肝臟病理性損傷及功能障礙。
　　 3、隨SAP進(jìn)展，血漿ET含量和Treg百分率升高，肝功能障礙及病理損傷加重，說明ET和Treg在SAP肝損傷中起重要作用，Treg對機(jī)體免疫系統(tǒng)的抑制可能是機(jī)制之一。