食品級(jí)釀酒酵母高效分泌-展示表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建.pdf

1、基因工程酵母菌在食品工業(yè)中的應(yīng)用逐漸普遍，但重組菌抗生素抗性標(biāo)記的存在對(duì)食品安全具有潛在隱患。此外，較低的生產(chǎn)成本、簡(jiǎn)單方便的下游操作技術(shù)和高水平的表達(dá)量等是工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白必須具備的特點(diǎn)。
　　 針對(duì)這些問(wèn)題，本課題根據(jù)半乳糖—葡萄糖對(duì)GAL基因家族誘導(dǎo)—抑制效應(yīng)以及GAL4P對(duì)GAL基因的調(diào)控機(jī)制，采用同源重組技術(shù)分步敲除了工業(yè)多倍體釀酒酵母MS—1染色體上的GAL1基因，并將GAL4基因整合到GAL1基因位點(diǎn)，構(gòu)建了

2、不同GAL基因型的重組酵母SG1、DG115、DPG65和GQ21。同時(shí)，選用α—半乳糖苷酶作為食品級(jí)選擇標(biāo)記、β—1，3—1，4—葡聚糖酶作為報(bào)告基因構(gòu)建了在GAL1啟動(dòng)子和MFα1信號(hào)肽控制指導(dǎo)下的食品級(jí)分泌表達(dá)載體YGMPA—PM；并以α—凝集素C—端320個(gè)氨基酸為錨定序列，構(gòu)建了能夠展示表達(dá)β—1，3—1，4—葡聚糖酶的食品級(jí)展示表達(dá)載體YGMPNA—PM。將構(gòu)建的載體和不同GAL基因型的重組酵母相結(jié)合，得到了適合工業(yè)化生產(chǎn)的

3、食品級(jí)高效分泌表達(dá)系統(tǒng)和食品級(jí)高效展示表達(dá)系統(tǒng)。主要研究結(jié)果如下：
　　 擴(kuò)增了GAL4結(jié)構(gòu)基因全長(zhǎng)序列，并構(gòu)建了包含GAL4基因+KanMX表達(dá)盒的模板質(zhì)粒PMD18—FGK。通過(guò)同源重組以GAL4+KanMX表達(dá)盒替換了工業(yè)三倍體酵母MS—1的三個(gè)等位的GAL1基因中的一個(gè)，得到具有雙GAL4的重組酵母。以KanMX為敲除框架，敲除了MS—1染色體上的一個(gè)GAL1基因。利用LFH原理，設(shè)計(jì)了另外兩套基因敲除框架KanMX—G

4、AL1s和GAL1+KanMX，依次敲除了雙GAL4重組菌株染色體上剩余的兩個(gè)GAL1等位基因?？紤]到重組菌株應(yīng)用的安全性，利用Cre/loxP系統(tǒng)切除了構(gòu)建重組釀酒酵母菌株時(shí)使用的KanMX抗性表達(dá)盒，并通過(guò)傳代使Zeocin抗性質(zhì)粒pSH47/ZEO丟失，得到不同GAL基因型的重組酵母SG1、DG115、DPG65和GQ21。其中，重組菌株GQ21染色體上三個(gè)GAL1基因全部缺失，且其中一個(gè)GAL1基因位點(diǎn)被整合了一個(gè)GAL4基因拷

5、貝。
　　 對(duì)不同GAL基因型的重組酵母SG1、DG115、DPG65和GQ21在含有不同碳源的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)、發(fā)酵性能以及抗性和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果表明，重組酵母的GAL基因型在傳代過(guò)程中保持穩(wěn)定，沒(méi)有發(fā)生回復(fù)突變且抗性基因已經(jīng)被徹底刪除。GAL1基因的缺失對(duì)重組菌株對(duì)葡萄糖的利用有輕微地影響。不同的培養(yǎng)方式影響重組酵母對(duì)半乳糖的利用。在YPG培養(yǎng)基中，GAL1基因敲除對(duì)酵母利用半乳糖的影響并不明顯， MS—1、SG1、

6、DG115在20h內(nèi)將培養(yǎng)基中的半乳糖全部消耗完畢，DPG65則在26h內(nèi)將半乳糖利用完畢。在YPGL培養(yǎng)基中，MS—1、SG1、DG115和DPG65利用完半乳糖的時(shí)間分別為20h、44h、44h和68h。在兩種培養(yǎng)模式中，GQ21培養(yǎng)基中的半乳糖濃度一直維持不變，表明GAL1基因確實(shí)已經(jīng)被完全敲除。GAL1基因的敲除和GAL4基因拷貝的增加沒(méi)有改變重組菌株的熱致死溫度。重組菌株和對(duì)照菌株的熱致死溫度仍然是54℃。
　　 構(gòu)建

7、了PGK1啟動(dòng)子控制下的α—半乳糖苷酶表達(dá)單元，并將此表達(dá)單元克隆到多拷貝質(zhì)粒YEPlac181上構(gòu)建了食品級(jí)克隆載體YPM。YPM轉(zhuǎn)化酵母后得到的重組子可以在以蜜二糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并能在涂有X—α—gal的培養(yǎng)上顯藍(lán)色，表明α—半乳糖苷酶已經(jīng)被有效表達(dá)。重組酵母/YPM在YPD培養(yǎng)基和MSD培養(yǎng)基中表達(dá)的α—半乳糖苷酶酶活最高為104U/ml和41.72U/ml；對(duì)照菌株安琪酵母表達(dá)的α—半乳糖苷酶存在蜜二糖/葡萄糖誘導(dǎo)—

8、抑制效應(yīng)，在YPD培養(yǎng)基和MSD培養(yǎng)基中的最高酶活為29.79U/ml和266.38U/ml。在MSD培養(yǎng)基中，安琪酵母12h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，32h進(jìn)入穩(wěn)定期；重組酵母YPM在68h后才開(kāi)始快速生長(zhǎng)，164h后進(jìn)入穩(wěn)定期。兩者在YPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)性能一致，8h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，32h達(dá)到穩(wěn)定期。
　　 擴(kuò)增了GAL1啟動(dòng)子、MFα1信號(hào)肽以及ADH1終止子基因序列，以β—1，3—1，4—葡聚糖酶為報(bào)告基因在克隆載體YPM的基礎(chǔ)上

9、構(gòu)建了食品級(jí)分泌表達(dá)載體YGMPA—PM。以α—半乳糖苷酶為篩選標(biāo)記，將載體YGMPA—PM轉(zhuǎn)入所構(gòu)建的重組酵母菌株SG1、DG115、DPG65和GQ21以及MS—1，在蜜二糖平板(MSD)挑選出了轉(zhuǎn)化子。測(cè)定不同GAL基因型酵母中β—1，3—1，4—葡聚糖酶的表達(dá)水平。結(jié)果表明，SG1、DG115、DPG65和GQ21的β—1，3—1，4—葡聚糖酶最高酶活分別為1523.48U/ml、2480.43U/ml、3161.53U/ml和

10、3991.00U/ml，為MS—1(846.37U/ml)的1.8倍、2.93倍、3.73和4.72倍，說(shuō)明酵母染色體上GAL1基因的敲除和GAL4基因拷貝的增加確實(shí)有利于提高外源蛋白表達(dá)的水平。重組分泌表達(dá)的β—1，3—1，4—葡聚糖酶的最適溫度為40℃，最適pH為6.0。50℃保溫2h后β—1，3—1，4—葡聚糖酶殘留酶活為51.90％；60℃保溫2h后的活力下降為初始酶活的20.14％。在pH4—6的范圍內(nèi)于4℃放置24h，酶活仍

11、能保持80％以上。
　　 擴(kuò)增了編碼α—凝集素C—末端320個(gè)氨基酸的基因序列并在載體YGMPA—PM的基礎(chǔ)上構(gòu)建了食品級(jí)展示表達(dá)載體YGMPNA—PM。將其與不同GAL基因型的重組酵母相結(jié)合構(gòu)建了食品級(jí)展示表達(dá)系統(tǒng)。此展示表達(dá)系統(tǒng)將β—1，3—1，4—葡聚糖酶成功展示表達(dá)在釀酒酵母細(xì)胞表面。通過(guò)平板鑒定和酶活測(cè)定確證了β—1，3—1，4—葡聚糖酶的正確定位。SG1、DG115、DPG65和GQ21展示表達(dá)的β—1，3—1，4—

12、葡聚糖酶最高酶活分別為84.98U/ml、118U/ml、161.55U/ml和201.87U/ml，分別為MS—1(45.10U/ml)的1.88倍、2.62倍、3.56倍和4.48倍。展示表達(dá)的β—1，3—1，4—葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變。最適溫度變?yōu)?0℃，熱穩(wěn)定性也被增強(qiáng)。50℃保溫3h對(duì)酶活幾乎沒(méi)有影響；60℃保溫1h殘留酶活為初始酶活的129.2％，60℃保溫3h后的酶活為初始酶活的64.6％。70℃保溫1h，酶活增加到初