PDMS微通道內金屬微點上DNA固定技術研究.pdf

1、微流控技術(microfluidics)由于可望實現(xiàn)大大降低試劑消耗，縮短反應時間，減少費用，眾多的集成潛力，正在成為新一代生物分析技術的重要推動力。結合微流控的原理與技術方式是當前包括基因芯片在內的生物微陣列技術發(fā)展的一個重要技術方向。為了實現(xiàn)DNA微陣列技術與微流控方式的融合，將DNA探針固定到微流控芯片的最基本組件——微通道中，是一個首要的重要步驟。
　　 微通道加工技術，在常規(guī)上是利用光刻工藝及其隨后興起的軟刻技術(so

2、ftlithography)來實現(xiàn)的。所以常規(guī)的微陣列與微流控結合方式，總伴隨著要對敞開微通道的閉合步驟，這對許多生物分析步驟帶來許多不利的后果。
　　 本文在基于軟刻策略的微絲模塑加工微通道的技術基礎上，通過十字交叉方式的處理工藝，直接一次成型地在微通道內構建出金屬微點及其陣列，為克服微陣列與微流控方式結合中常規(guī)需要作后端閉合處理的缺陷提供了重要條件。本文也由此出發(fā)，討論的重點即是如何在這樣形成的微通道內壁的微點上來實施DNA

3、探針的固定，并通過雜交過程來檢驗固定過程的可靠性。
　　 微通道內DNA固定實驗采取了三種方式：巰基DNA探針與金微點的共價結合，DNA探針在微通道內作為電極的不銹鋼微點上的吸附，DNA探針在微通道內經(jīng)聚吡咯修飾的電極上的固定。
　　 結果發(fā)現(xiàn)：(1)在微通道內的DNA-FAM與金微點上固定經(jīng)過16小時的孵育，48小時固定，隨后與HS-DNA作用5小時即有肉眼可見的熒光微點出現(xiàn)，這表明在微通道內的雜交時間明顯縮短。(2)

4、在直流電作用下，帶有負電荷HS-DNA-FAM在微通道內不銹鋼微點電極上的吸附?jīng)]有按照預想情況出現(xiàn)在陽極端，相反卻出現(xiàn)在陰極微點表面，由電吸附形成的陰極熒光微點的強度與微點面積大小，DNA濃度，電解質濃度，電極之間的距離及通電時間有關。①在20微米直徑的微通道中，始終沒有出現(xiàn)可見的熒光微點，40，60，80，100μm不銹鋼絲交叉點的面積與陰極電極吸附的DNA的熒光強度成正比。②在其他條件恒定的情況下，隨著DNA濃度在0.00305-1

5、2.5nmol/ml之間逐漸增加時，不銹鋼微點上電吸附的ssDNA微點熒光強度在持續(xù)增大，但是在大于0.78125nmol/ml后影響微小。當DNA濃度在0.00305nmol/ml時由于DNA濃度過小，難以在較短時間內在不銹鋼微點上形成有效地肉眼可見的DNA熒光微點。③在其他條件恒定的情況下NaCL濃度在0.063-0.25mol/L之間逐漸增加時，不銹鋼微點上電吸附的ssDNA微點熒光強度在持續(xù)增大，但是在大于0.25mol/L后影

6、響微小。當NaCL濃度在0.063mol/L時，難以在50s在不銹鋼微點上形成有效地肉眼可見的DNA熒光。④在其他條件恒定的情況下，電極間距逐漸增加時，不銹鋼微點上電吸附的ssDNA微點熒光強度不斷持續(xù)減小，電極間距逐大于520微米后在不銹鋼微點上難以形成有效的肉眼可見的DNA熒光微點。⑤在其他條件恒定的情況下，隨著通電時間在0-200s之間逐漸增加時，不銹鋼微點上電吸附的ssDNA微點熒光強度在持續(xù)增大。在可控的第6秒時，即有可見熒光

7、微點出現(xiàn)，但是在大于100s后熒光強度變化影響微小。(3)在微通道內的不銹鋼微點表面鋪上一層無交聯(lián)劑的PDMS后，通過電化學方法把(10個伏安循環(huán)，20分鐘)聚吡咯修飾在微點表面，同時固定靶DNA，隨后進行溫度差異，及雜交與非雜交過程導致的伏安循環(huán)電流變化(10個伏安循環(huán)，20分鐘)，結果顯示在最適溫度條件下，其電流信號增大了32.03倍，而在室溫條件下僅增大了3.51倍；有雜交行為出現(xiàn)時，其電流信號較基礎電流凈增大了127.273倍；

8、而無雜交行為出現(xiàn)時，其電流信號較基礎電流僅僅凈增大了21.4倍。
　　 在三種實驗比較中，在微通道內在金微點表面DNA固定時間最長，與互補鏈雜交的形成所需時間也最長，但是仍舊比在開放液池條件下雜交要快得多。在電吸附試驗中，F(xiàn)AM-DNA-HS在最短可控的第6秒既有可見熒光微點出現(xiàn)，但是需要用直流電維持，并且對其后的雜交試驗造成了不利影響。在通過聚吡咯固定DNA所需時間介于以上兩種試驗之間，也僅需20分鐘，雜交時間僅20分鐘，速度