黃原膠生物降解及其寡糖生理活性的研究.pdf

1、功能性寡糖多來(lái)自于細(xì)胞壁多糖水解，在植物誘抗、抑制病原菌、增強(qiáng)免疫力、改善胃腸功能等方面具有重要生理活性。黃原膠是植物致病菌野油菜黃單胞菌所分泌的胞外多糖，其主鏈類(lèi)似纖維素很難降解，除作為生物膠集增稠、懸浮、乳化、穩(wěn)定于一體外，還是植物毒素因子，能引起十字花科植物黑腐病。本論文研究目的是通過(guò)生物方法降解黃原膠，進(jìn)而去除十字花科植物黑腐病的毒素因子，同時(shí)探討黃原膠降解后所產(chǎn)寡糖是否具有特殊的生理活性。 從土壤中分離出黃原膠降解菌株

2、XT11。經(jīng)菌體表觀(guān)特征、菌落形態(tài)、生理生化鑒定等傳統(tǒng)細(xì)菌分類(lèi)鑒定，以及G+C含量、16SrRNA基因序列相似性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析等現(xiàn)代分子生物學(xué)鑒定，最終確定菌株XT11是微桿菌屬M(fèi)icrobacterium一新種。與M.hydrocarbonoxydans親緣關(guān)系最近，相似性97.8％，遺傳距離0.008。黃原膠降解菌株XT11的16SrRNA基因序列GenBank登陸號(hào)為DQ350882。同時(shí)對(duì)微桿菌屬的進(jìn)化遺傳關(guān)系進(jìn)行聚類(lèi)分析，

3、微桿菌屬共分兩大簇群，其中黃原膠降解菌XT11與近緣菌M.hydrocarbonoxydans構(gòu)成一子分支，置信度為85％。 降解菌Microbacteriumsp.XT11分泌胞外黃原膠降解酶，降解黃原膠主鏈?zhǔn)蛊湔扯冉档?，產(chǎn)黃原膠寡糖。黃原膠降解酶為底物誘導(dǎo)酶。黃原膠、CMC、淀粉、麥芽糖等結(jié)構(gòu)相似，均是其誘導(dǎo)劑，其中黃原膠誘導(dǎo)作用最佳。黃原膠降解菌XT11適宜發(fā)酵產(chǎn)酶條件為：0.3％黃原膠、0.3％酵母浸粉的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，初始

4、pH7.0，28℃160r/min溶氧培養(yǎng)。培養(yǎng)基外加葡萄糖，雖促進(jìn)XT11菌體自身生長(zhǎng)，但卻抑制黃原膠誘導(dǎo)產(chǎn)酶。蔗糖、乳糖、麥芽糖、淀粉和纖維素等碳源，也不同程度抑制黃原膠降解酶的誘導(dǎo)合成。 從黃原膠降解菌XT11發(fā)酵產(chǎn)酶特性來(lái)看，隨著發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，降解菌不斷增長(zhǎng)，發(fā)酵液粘度迅速下降，黃原膠降解酶活力逐漸上升。發(fā)酵28h時(shí)酶活達(dá)到最高23U/mL。黃原膠降解酶酶學(xué)性質(zhì)初步分析表明，作用黃原膠最適反應(yīng)溫度40℃，最適反應(yīng)pH

5、值6.0，最適底物濃度0.4％(w/v)。當(dāng)葡萄糖濃度高于0.06％時(shí)，對(duì)黃原膠降解酶的酶促反應(yīng)具有抑制作用。且葡萄糖濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。黃原膠降解酶使酶解反應(yīng)液粘度和還原糖含量呈現(xiàn)良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明黃原膠類(lèi)似纖維素的主鏈發(fā)生降解，這正是黃原膠降解產(chǎn)生寡糖所必需的。 黃原膠降解菌XT11降解黃原膠可得到不同粘度/還原糖比值的黃原膠寡糖。黃原膠降解寡糖生理活性研究表明，黃原膠自身無(wú)清除自由基能力，其降解寡糖卻具有清除羥基自由

6、基活性，且活性與寡糖濃度基本呈正相關(guān)。寡糖聚合度是影響活性的主要因素，其中黃原膠寡糖S6(粘度/還原糖比40.9)羥基自由基清除能力最強(qiáng)。黃原膠寡糖只抑制植物病原菌野油菜黃單胞菌Xanthomonascampetris生長(zhǎng)，而對(duì)大腸桿菌Esherichiacoli、胡蘿卜軟腐歐文氏菌Erwiniacarotovora，傷寒沙門(mén)氏菌Salmonellatyphi、綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa、變形鏈球菌Strepto

7、coccusmutans、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis等其它供試病原菌均無(wú)抑制作用。黃原膠寡糖使大豆子葉呈現(xiàn)誘抗活性，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，提高植物抗病性。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，黃原膠寡糖S4、S5(粘度/還原糖比分別為232.5和101.4)對(duì)野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xcc)抑菌活性尤為顯著。黃原膠寡糖不僅抑制野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xcc)生長(zhǎng)，