人體腸道微生物對(duì)瓊膠與κ-卡拉膠及其寡糖的降解和利用研究.pdf

1、本論文以瓊膠和k-卡拉膠及其寡糖為研究對(duì)象,采用腸道微生物體外發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù),研究了它們?cè)谌梭w腸道微生物中的降解和利用情況,并進(jìn)一步探討了它們的代謝產(chǎn)物對(duì)腸道微生物菌群的影響。利用所建立模型,首次從人腸道微生物中分離得到1株降解瓊膠及其寡糖和2株降解k-卡拉膠寡糖的腸道細(xì)菌,對(duì)其所產(chǎn)糖苷酶類型進(jìn)行了分析。首次發(fā)現(xiàn)這些腸道微生物在降解瓊膠及其寡糖和卡拉膠寡糖時(shí)均存在共生現(xiàn)象。首次建立了k-卡拉膠寡糖降解菌定殖小鼠模型,并發(fā)現(xiàn)降解菌定殖及降解

2、菌定殖并喂卡拉膠寡糖的小鼠結(jié)腸炎癥程度較大,提示卡拉膠致炎可能與腸道中的降解菌有關(guān)。
　　人體腸道微生物對(duì)瓊膠及其寡糖的降解結(jié)果顯示,來自不同人的腸道微生物對(duì)瓊膠和瓊膠寡糖的降解速度和降解方式不同。采用初步培養(yǎng)富集和平板篩選的方法,從可降解人群糞便中分離得到一株具有降解瓊膠及其寡糖的細(xì)菌,經(jīng)16S rDNA鑒定為單形擬桿菌B. uniformis L8(菌種保藏號(hào)CGMCC No.8711)。B. uniformis L8不僅可將

3、瓊膠降解為寡糖,而且能將瓊膠寡糖進(jìn)一步降至半乳糖;與其伴生的大腸桿菌Escherichia coli B2不能降解瓊膠及其寡糖,但是可以利用L8降解產(chǎn)生的半乳糖,兩者的共生可以將瓊膠和瓊膠寡糖完全利用,并促進(jìn)其自身的生長。TLC結(jié)合生長曲線結(jié)果顯示L8具有特異性降解瓊膠糖苷鍵的作用,而對(duì)其他海洋糖類如卡拉膠寡糖、寡聚甘露糖醛酸鈉、寡聚古羅糖醛酸鈉和褐藻膠等沒有降解作用。采用MS和NMR對(duì)L8降解瓊膠的中間產(chǎn)物進(jìn)行分析,結(jié)果顯示降解產(chǎn)物為

4、新瓊膠寡糖,證明L8產(chǎn)生的糖苷酶為β-瓊膠酶,特異性降解半乳糖和3,6-內(nèi)醚半乳糖之間的β-1,4-糖苷鍵,這是首次從人腸道微生物中發(fā)現(xiàn)該酶。
　　人體腸道微生物對(duì)不同分子量的κ-卡拉膠的降解結(jié)果表明,與中性糖瓊膠相比,含有硫酸根的κ-卡拉膠降解難度較大,研究的幾種不同分子量的κ-卡拉膠中,分子量為450 kDa,100 kDa的κ-卡拉膠都不能被人體腸道微生物降解,只有4.5 kDa的κ-卡拉膠寡糖可以被大多數(shù)人的腸道微生物降解

5、,但降解速度因人而異。采用直接分離以及抗生素輔助分離的方法,從可降解人群的糞便中各分得一組降解κ-卡拉膠寡糖的腸道細(xì)菌:其中一組是在人群中分布廣泛的木糖降解擬桿菌Bacteroides xylanisolvens和大腸桿菌Escherichia coli C1;另一組是較為少見的短小桿菌Dialister sp.和大腸桿菌Escherichia coli B3。這兩組菌均可以將分子量為4.5 kDa的κ-卡拉膠寡糖降至卡拉膠七糖、五糖、

6、三糖和4-硫酸半乳糖以及少量的新卡拉膠四糖和二糖。在進(jìn)一步分離純化過程中,發(fā)現(xiàn)降解κ-卡拉膠寡糖的兩組菌都存在共生現(xiàn)象,其中B. xylanisolvens和Dialister sp.屬于κ-卡拉膠寡糖降解菌,大腸桿菌屬于伴生菌。通過采用TLC和MS技術(shù)分析B. xylanisolvens降解κ-卡拉膠寡糖產(chǎn)物結(jié)構(gòu),確定B. xylanisolvens所產(chǎn)糖苷酶為κ-卡拉膠酶,特異性降解4-硫酸-半乳糖和3,6-內(nèi)醚半乳糖之間的β-1,

7、4-糖苷鍵,這是首次從人腸道微生物中發(fā)現(xiàn)該酶。
　　從上世紀(jì)60年代開始,卡拉膠寡糖因其可能導(dǎo)致腸道炎癥、促進(jìn)腸癌發(fā)生而備受關(guān)注,論文從κ-卡拉膠寡糖降解菌的角度初步探討了卡拉膠寡糖的致炎機(jī)理。通過比較無菌鼠、無菌鼠喂κ-卡拉膠寡糖、降解菌(木糖降解擬桿菌 B. xylanisolvens和大腸桿菌E. coli)定殖小鼠和降解菌定殖小鼠喂κ-卡拉膠寡糖四組小鼠結(jié)腸的HE染色病理切片發(fā)現(xiàn),接種降解菌以及接種降解菌并喂κ-卡拉膠寡糖

8、組小鼠結(jié)腸炎癥程度較高。這提示降解菌可能是卡拉膠寡糖致炎的原因之一。
　　綜上所述,本文對(duì)瓊膠、κ-卡拉膠及其寡糖在人體腸道微生物中的降解和利用進(jìn)行了較深入系統(tǒng)的研究,分離得到1株瓊膠和2株κ-卡拉膠寡糖降解菌株,分析了菌株所產(chǎn)糖苷酶的類型,揭示了腸道菌群在降解碳水化合物過程中的共生現(xiàn)象,為進(jìn)一步研究腸道微生物對(duì)瓊膠、κ-卡拉膠及其寡糖的代謝提供了理論基礎(chǔ),同時(shí)論文中建立的篩菌模式也為其他功能菌的篩選提供了借鑒。限定菌小鼠實(shí)驗(yàn)首次