胰島素治療通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善2型糖尿病大鼠肝臟胰島素敏感性和脂肪沉積.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)監(jiān)控蛋白質(zhì)加工并保證蛋白質(zhì)能準(zhǔn)確地折疊,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子穩(wěn)態(tài)的改變、蛋白質(zhì)過量生成和未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)蓄積能引發(fā)細(xì)胞特異性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要激活三條信號(hào)通路:未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded proteinresponse,UPR),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)和固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。UPR的最初目的是適應(yīng)環(huán)境的改變,通過跨膜蛋白ATF6、PERK、IRE1/XBP1轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR的信號(hào),恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能。但是,如果這些適應(yīng)性反

2、應(yīng)不能有效去除應(yīng)激狀態(tài),過強(qiáng)或長(zhǎng)期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)副作用,如凋亡和胰島素抵抗等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病之間的一種分子聯(lián)系,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以導(dǎo)致胰島素受體信號(hào)的抑制,而這種抑制作用是通過IRE-1α依賴性JNK激活所致。固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面合成的膽固醇損耗所致,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面合成膽固醇的耗竭可激活固醇調(diào)節(jié)反應(yīng)結(jié)合蛋白(SREBPs),其中,SREBP-1c是調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝有關(guān)酶的重要轉(zhuǎn)錄因

3、子,能選擇性調(diào)控脂肪酸、甘油三酯以及糖代謝(如葡萄糖激酶)相關(guān)基因的表達(dá)水平。
　　 作為一種合成激素,胰島素能明顯促使蛋白質(zhì)的合成。如果胰島素誘導(dǎo)合成的多肽鏈超過了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的折疊能力將導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊蛋白或未折疊蛋白的增加,從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。那么,在1型和2型糖尿病治療中被廣泛應(yīng)用的胰島素是否會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并因此而導(dǎo)致胰島素抵抗目前尚未有相關(guān)的研究證實(shí)。一些臨床研究發(fā)現(xiàn)胰島素治療能改善全身胰島素抵抗或抑制肝糖輸出,但

4、在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中胰島素治療對(duì)肝臟胰島素信號(hào)通路的作用及其分子機(jī)制目前不還清楚。胰島素是SREBP1的激活因子,能導(dǎo)致肝細(xì)胞和脂肪細(xì)胞脂肪沉積增加,但在2型糖尿病大鼠中,胰島素治療是否也會(huì)導(dǎo)致肝臟脂肪沉積增加也值得進(jìn)一步的研究。本研究先建立2型糖尿病動(dòng)物模型,給予胰島素治療,然后檢測(cè)肝臟胰島素信號(hào)通路活性、肝糖異生關(guān)鍵酶的表達(dá)、JNK活性、IRE1a/XBP1通路、BiP及SREBP1等指標(biāo)的變化,探討胰島素對(duì)肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島素敏感性的作

5、用及其分子機(jī)制,并且研究胰島素治療對(duì)肝臟脂肪沉積的影響并探討其機(jī)制。
　　 研究目的:
　　 1.研究胰島素治療對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的影響
　　 2.研究胰島素治療對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟胰島素敏感性的影響及其分子機(jī)制
　　 3.觀察胰島素治療對(duì)肝臟脂肪沉積的影響并探討其分子機(jī)制
　　 1材料與方法:
　　 1.1動(dòng)物模型:
　　 8周齡清潔級(jí)近交系雄性SD大鼠60只,重約2

6、00g左右,適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后,將SD大鼠隨機(jī)分成常規(guī)飼料喂養(yǎng)組(NC,n=10)和高脂飼料喂養(yǎng)組(HFD,n=50)。分別用相應(yīng)飼料喂養(yǎng)5周,第5周末禁食12小時(shí)后,HFD組大鼠腹腔內(nèi)一次性注射STZ(STZ40mg/kg體重)。注射STZ三天后測(cè)非空腹血糖。非空腹血糖大于16.7mmol/L為糖尿病大鼠。將這些糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病組(DM,n=6,不給予藥物干預(yù))、早期胰島素治療(EI,n=6,STZ注射三天后診斷為糖尿病即開始給

7、予皮下胰島素注射)、達(dá)美康治療組(GT,n=6,STZ注射三天后診斷為糖尿病即開始給予達(dá)美康灌胃治療)和晚期胰島素治療組(LI,n=6,STZ注射一月后開始給予皮下胰島素注射),正常對(duì)照組和糖尿病組大鼠給予相同體積的生理鹽水皮下注射治療,療程為三周。目標(biāo)血糖為4-8mmol/L,根據(jù)血糖濃度調(diào)整胰島素和達(dá)美康的劑量。
　　 1.2腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)
　　 胰島素和達(dá)美康治療結(jié)束兩天后進(jìn)行腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)。禁食12小時(shí)后

8、,給予大鼠腹腔注射1.5克k_1體重50％的葡萄糖。尾靜脈取血(0分鐘、30分鐘和120分鐘)作血糖和血清胰島素檢測(cè),以葡萄糖曲線下面積和胰島素曲線下面積計(jì)算葡萄糖胰島素指數(shù)。
　　 1.3 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
　　 肝臟總蛋白用細(xì)胞裂解液提取,14000rpm離心后取上清液分裝備用。蛋白濃度使用BCA法測(cè)定,每個(gè)樣本加入上樣緩沖液,每泳道加入約100ug蛋白。65V電泳,待溴酚藍(lán)越過濃縮膠后改

9、為200V,蛋白分離后開始轉(zhuǎn)膜,電壓110V。轉(zhuǎn)膜后6％脫脂牛奶封閉1小時(shí),4℃過夜孵育一抗,洗膜后常溫下孵育二抗1小時(shí),再用TBST洗膜后曝光,選取清晰的X光膠片進(jìn)行圖像分析。
　　 1.4磷酸化IRS1的檢測(cè)
　　 加IRS1抗體至樣品中,4℃搖床上孵育過夜,加入0.04ml蛋白A至小cup中,4000g離心1分鐘,將免疫復(fù)合物加入小cup中,孵育10分鐘,4000g離心1分鐘,加0.5ml Binding/wash

10、 buffer至小cup中4000g離心1分鐘,加190ulElution Buffer至免疫復(fù)合物中,4000g離心1分鐘,收集液層作SDS-PEGA電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗和二抗及曝光。
　　 1.5JNK活性檢測(cè)
　　 加20ul珠子至200ul樣品中后4℃搖床上孵育過夜。4℃離心,14000g,10min。加500ul1×cell lysis buffer洗洗滌沉淀物2次,加500ul1×kinase buffer,

11、旋轉(zhuǎn)洗滌沉淀物2次,棄上清,加50ul1×kinase buffer,200MATP重懸沉淀物,4℃水浴箱內(nèi)孵育30分鐘,加25ul3×SDS Sample buffer終止反應(yīng),常溫下離心30秒。收集液層作SDS-PEGA電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗和二抗及曝光。
　　 1.6肝臟甘油三酯提取
　　 100毫克肝組織在冰冷的氯仿-甲醇(體積比為2:1)溶液中手動(dòng)勻漿。在室溫下孵育5小時(shí)后加氯仿,離心。收集底部沉渣、風(fēng)干后在融解

12、在氯仿中,離心后收集上清夜使用酶法檢測(cè)。
　　 1.7 Real Time PCR
　　 采用Sybrgreen染料法,以β-actin為內(nèi)參基因,對(duì)HIF1α和Glut1基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線,相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步用樣品的目的基因減去管家基因測(cè)得值來校正誤差,所得結(jié)果代表樣品目的基因的相對(duì)含量。
　　 1.8統(tǒng)計(jì)分析
　　 數(shù)據(jù)用均數(shù)

13、±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較使用t檢驗(yàn),多組之間比較用方差分析。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2結(jié)果:
　　 2.12型糖尿病模型的建立
　　 為了建立2型糖尿病動(dòng)物模型,本研究使用高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素。血清胰島素水平和甘油三酯在高脂飲食喂養(yǎng)5周時(shí)升高,提示SD大鼠存在胰島素抵抗。注射小劑量STZ三天后血糖水平顯著升高,研究結(jié)束是糖化血紅蛋白也明顯升高,除此之外,這些糖尿病大鼠也表現(xiàn)出對(duì)胰島素促泌劑有反

14、應(yīng),這些結(jié)果說明了本研究誘導(dǎo)出了一種具有2型糖尿病典型代謝特點(diǎn)的大鼠模型。
　　 2.2胰島素對(duì)2型糖尿病大鼠的治療效果
　　 為了研究胰島素治療的作用機(jī)制,胰島素的治療活性在動(dòng)物模型中被調(diào)查。早期胰島素治療組糖代謝指標(biāo)如空腹血糖和糖化血紅蛋白以及甘油三酯水平均明顯降低。為了評(píng)價(jià)胰島素敏感性,在胰島素治療后檢測(cè)大鼠腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn),計(jì)算葡萄糖-胰島素指數(shù),結(jié)果顯示早期治療組大鼠葡萄糖-胰島素指數(shù)明顯降低,這些結(jié)果說

15、明了胰島素治療改善了糖尿病大鼠的胰島素敏感性。晚期胰島素治療組對(duì)空腹血糖和糖化血紅蛋白,甘油三酯以及葡萄糖-胰島素指數(shù)也有一定的治療效果,但療效不如早期胰島素治療組。
　　 2.3胰島素改善肝臟胰島素作用
　　 肝臟組織的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化胰島素底物受體1被用來評(píng)價(jià)肝臟的胰島素敏感性。免疫沉淀和免疫印跡方法檢測(cè)肝臟細(xì)胞的總蛋白IRS1絲氨酸307位點(diǎn)的磷酸化水平在糖尿病大鼠中明顯升高,但胰島素治療后,絲氨酸磷酸化IRS

16、1水平明顯降低,這說明了胰島素信號(hào)通路的改善。
　　 為了評(píng)價(jià)胰島素的活性,檢測(cè)肝臟PEPCK和G6P蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示PEPCK和G6P蛋白表達(dá)水平在糖尿病組大鼠中升高,胰島素治療后降低。在早期胰島素治療組和晚期胰島素治療組絲氨酸磷酸化IRS1、PEPCK和G6P蛋白表達(dá)水平之間的差異沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但早期和晚期治療組均降低絲氨酸磷酸化IRS1、PEPCK和G6P蛋白表達(dá)水平,這表明了胰島素治療改善了肝臟胰島素的反應(yīng)性

17、。
　　 2.4胰島素治療對(duì)肝臟JNK活性的影響
　　 為了進(jìn)一步闡明IRS1的絲氨酸磷酸化,肝臟的JNK活性被檢測(cè)。JNK活性使用JNK1蛋白水平的變化及其激酶活性來評(píng)價(jià)。磷酸化c-Jun水平在糖尿病大鼠組中明顯升高,經(jīng)過胰島素治療后顯著降低,而且早期胰島素治療組與晚期胰島素治療組比較,磷酸化c-Jun水平下降的更明顯。JNK的三種亞單位之一的JNK1蛋白水平在糖尿病大鼠肝臟升高,而胰島素治療后JNK1蛋白水平下降。這

18、說明糖尿病大鼠肝臟的JNK活性升高,但是胰島素治療后其活性顯著降低。
　　 2.5胰島素治療對(duì)IRE1α/XBP—1通路的影響
　　 IRS1的絲氨酸磷酸化由JNK介導(dǎo),而JNK由IRE1α激活。為了理解JNK的激活,肝臟組織IRE1α/XBP-1通路的變化被檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),糖尿病組IRE1α的蛋白表達(dá)水平明顯升高,而在胰島素治療組中IRE1α蛋白表達(dá)水平降低。IRE1α的底物XBP-1也被檢測(cè)。糖尿病組剪切和未剪切的X

19、BP-1蛋白表達(dá)水平明顯升高,而在胰島素治療組中剪切和未剪切的XBP-1蛋白表達(dá)水平降低。另外,在早期胰島素治療和晚期胰島素治療組IRE1α和剪切和未剪切的XBP-1蛋白表達(dá)水平并沒有明顯不同。這說明了糖尿病組中IRE1α/XBP-1通路活性明顯升高,而胰島素治療后這一通路的活性下調(diào)。
　　 2.6胰島素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響
　　 生理濃度的胰島素能誘導(dǎo)培養(yǎng)的鼠腹膜巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與胰島素抵抗相關(guān)。為了評(píng)價(jià)

20、胰島素治療對(duì)動(dòng)物模型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的影響,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物免疫球蛋白結(jié)合蛋白(BIP)的蛋白表達(dá)水平被檢測(cè)。肝臟的BIP蛋白表達(dá)水平在糖尿病大鼠中明顯升高,但胰島素治療后BIP蛋白表達(dá)水平明顯下降,而且與晚期胰島素治療組比較,早期胰島素治療組BIP蛋白表達(dá)水平下降得更明顯。這說明了胰島素治療并沒有增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而是減輕了糖尿病大鼠肝臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　 2.7胰島素對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟脂肪沉積的治療效果
　　 為了評(píng)價(jià)胰

21、島素對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟脂肪沉積的治療效果,檢測(cè)肝臟標(biāo)本的甘油三酯,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照比較,糖尿病組大鼠肝臟的甘油三酯含量增加,經(jīng)過胰島素治療后,早期胰島素治療組和晚期胰島素治療組大鼠肝臟的甘油三酯含量下降,說明了胰島素治療減輕了2型糖尿病大鼠模型肝臟的脂質(zhì)沉積。
　　 2.8胰島素治療對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟SREBP1蛋白表達(dá)的影響
　　 為了研究胰島素治療減輕了2型糖尿病大鼠模型肝臟的脂質(zhì)沉積的機(jī)制,本研究檢測(cè)了肝臟脂肪代

22、謝調(diào)控的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子SREBP1蛋白表達(dá)的變化。糖尿病組大鼠與正常對(duì)照組比較SREBP1蛋白水平表達(dá)明顯增加,經(jīng)過胰島素治療后SREBP1蛋白水平表達(dá)下降。并且與晚期胰島素治療組比較,早期胰島素治療組SREBP1蛋白水平表達(dá)的下降的程度更明顯。這提示糖尿病組大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活,經(jīng)過胰島素治療組該反應(yīng)下調(diào)。
　　 2.9胰島素治療對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟PPARa蛋白表達(dá)的影響
　　 PPARa是肝臟脂肪

23、代謝調(diào)控的另一個(gè)重要因素,并且也對(duì)SREBP1的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用。糖尿病組大鼠與正常對(duì)照組比較PPARa蛋白水平表達(dá)增加,經(jīng)過胰島素治療后PPARa蛋白水平表達(dá)進(jìn)一步增加。這些結(jié)果提示糖尿病組和胰島素治療組大鼠PPARa被激活。
　　 2.10胰島素治療對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟缺氧反應(yīng)的影響
　　 缺氧與脂肪肝關(guān)系密切,缺氧誘導(dǎo)因子1a調(diào)控SREBP1的表達(dá),本研究檢測(cè)了介導(dǎo)缺氧反應(yīng)的分子mRNA或蛋白表達(dá)水平的變化。糖尿病

24、組大鼠與正常對(duì)照組比較HIF—1a mRNA和及其下游信號(hào)分子Glut1mRNA表達(dá)增加,經(jīng)過胰島素治療后下降,說明了胰島素治療是糖尿病大鼠肝臟的缺氧得到了部分緩解。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶ORP150能被缺氧特異性誘導(dǎo),本研究檢測(cè)了ORP150蛋白水平的變化,糖尿病組大鼠與正常對(duì)照組比較ORP150蛋白表達(dá)增加,經(jīng)過胰島素治療后ORP150表達(dá)下降,說明了胰島素治療改善了糖尿病大鼠肝臟缺氧狀態(tài)。
　　 結(jié)論: