表達(dá)Tsol18抗原的口服減毒鼠傷寒沙門氏菌重組活載體疫苗的構(gòu)建及其免疫學(xué)研究.pdf

1、囊尾蚴病(Cysticercosis)是由豬帶絳蟲(Taeniasolium)的幼蟲囊尾蚴(Cysticercuscellulosae)寄生于人或豬等而引起的人畜共患寄生蟲病，是公認(rèn)的世界經(jīng)濟(jì)病之一。囊尾蚴病在中國(guó)大部分地區(qū)尤其在少數(shù)民族地區(qū)是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重威脅著人體健康，不僅如此，豬囊尾蚴病的廣泛存在極大影響了我國(guó)畜產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力，給畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，豬囊尾蚴病的免疫防治勢(shì)在必行，然而在豬囊尾蚴病疫苗研究

2、中，疫苗抗原的選擇和來源一直困擾著獸醫(yī)工作者。Tsol18是豬帶絳蟲六鉤蚴(T.soliumoncosphere)階段特異性表達(dá)的抗原，主要在六鉤蚴感染中間宿主的早期階段分泌，其免疫血清在體外試驗(yàn)中能殺死六鉤蚴，是豬囊尾蚴病疫苗研制的主要候選抗原之一。在已有的研究中，Tsol18重組蛋白在原核系統(tǒng)中多以包涵體形式表達(dá)，給蛋白質(zhì)的復(fù)性和純化帶來許多困難，并且包涵體活性較低、保存期短、降解快，因而限制了Tsol18在豬囊尾蚴病疫苗研制上的應(yīng)

3、用。 鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)是一種常見的侵襲性胞內(nèi)菌，通過基因工程方法減毒后對(duì)宿主致病性顯著降低，但仍保留良好的侵襲力，可將免疫抗原直接遞呈給免疫細(xì)胞而誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，減毒鼠傷寒沙門氏菌作為口服疫苗載體是目前疫苗免疫研究的熱點(diǎn)之一。為了優(yōu)化豬囊尾蚴病疫苗候選抗原Tsol18重組蛋白，探索豬囊尾蚴病口服重組活載體疫苗的免疫應(yīng)答，研究其在豬囊尾蚴病免疫預(yù)防上的作用，進(jìn)行了本項(xiàng)研究。

4、 收集成熟的豬帶絳蟲蟲卵，經(jīng)孵化和激活后，提取六鉤蚴總RNA，設(shè)計(jì)特異性引物RT-PCR擴(kuò)增Tsol18基因片段，并同義突變Tsol18基因片段中四個(gè)大腸桿菌低利用率密碼子，截去其N端的16個(gè)氨基酸的信號(hào)肽編碼序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-Tsol18并表達(dá)，進(jìn)行GST-Tsol18重組蛋白的SDS-PAGE、Westernblot及穩(wěn)定性分析，并以GST-Tsol18重組蛋白為抗原制備兔高免血清；將改造的Tsol18基因片

5、段插入Asd+的組成型表達(dá)載體pYA3341，構(gòu)建重組載體pYA3341-Tsol18，將重組載體電轉(zhuǎn)化入缺失腺苷酸環(huán)化酶(Δcya)、環(huán)腺苷酸受體蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸-β-半醛脫氫酶(Δasd)的減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550，研究重組活載體疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)表達(dá)Tsol18重組蛋白的免疫原性、生長(zhǎng)穩(wěn)定性、口服安全性及在小鼠體內(nèi)的分布情況，ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清和腸液中抗Tsol18抗體的產(chǎn)生

6、情況，流式細(xì)胞術(shù)分析其脾細(xì)胞亞型的分化，ELISA檢測(cè)免疫豬血清中抗Tsol18抗體的動(dòng)態(tài)變化，探討重組疫苗可能的免疫應(yīng)答。 結(jié)果顯示改造后的GST-Tsol18重組蛋白多以可溶性形式表達(dá)，蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的24％，Westernblot證明GST-Tsol18重組蛋白具有良好的抗原性，4℃保存120d只有20.1％降解，顯示重組蛋白穩(wěn)定性有很大改善。重組疫苗4550(pYA3341-Tsol18)在沒有選擇壓力的情況下連

7、續(xù)培養(yǎng)100代后，隨機(jī)挑選的重組疫苗株全部都能生長(zhǎng)和表達(dá)Tsol18重組蛋白，表明重組疫苗生長(zhǎng)穩(wěn)定；BALB/c鼠口服重組疫苗株2.0×1012cfu30天后，存活率100％，證實(shí)重組疫苗口服安全可靠，小鼠口服免疫后第21天在脾臟仍能測(cè)到大量的重組疫苗株，表明重組疫苗在體內(nèi)能夠長(zhǎng)久存活，有利于刺激機(jī)體產(chǎn)生持久的免疫應(yīng)答；ELISA檢測(cè)顯示在二免后四周小鼠血清中抗Tsol18IgG抗體的OD值達(dá)到0.645，二免后六周小鼠腸液中有抗Tso

8、l18分泌性IgA抗體產(chǎn)生，表明重組疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體水平和激發(fā)多種免疫應(yīng)答方式；免疫小鼠的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)目明顯增多，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值也顯著增高(P＜0.01)，提示口服疫苗4550(pYA3341-Tsol18)可能同時(shí)誘導(dǎo)Th1和Th2免疫應(yīng)答反應(yīng)。豬免疫后20d抗Tsol18IgG抗體水平開始上升，在二免后30天抗體OD值達(dá)到1.025，表明重組疫苗能誘導(dǎo)豬產(chǎn)生抗豬囊尾蚴病的免疫應(yīng)答效應(yīng)。