基于調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的腦脈通對(duì)I-R老齡大鼠腦微血管生成機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　腦缺血后若能及時(shí)在再灌注時(shí)間窗內(nèi)恢復(fù)半暗帶區(qū)的血氧供應(yīng)，可以挽救神經(jīng)元生理功能，改善患者預(yù)后。然而，隨著缺血區(qū)血液供應(yīng)的恢復(fù)，也可能導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷和功能障礙，即缺血再灌注損傷。因此，如何減輕腦缺血再灌注損傷成為目前缺血性腦血管病治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。最近研究表明，缺血缺氧后，腦組織可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)，啟動(dòng)自身性血管生成機(jī)制，逐漸建立起自身側(cè)支循環(huán)，以適應(yīng)或抵抗腦局部缺血缺氧，減輕再灌注損傷。缺血性腦卒中后參

2、與血管生成的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路較多且機(jī)制較為復(fù)雜，其中PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腦部缺血半暗帶區(qū)微血管生成和側(cè)枝循環(huán)的建立密切相關(guān)，其信號(hào)效應(yīng)分子的表達(dá)，受細(xì)胞內(nèi)外多種因素的調(diào)節(jié)，從而在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而這種內(nèi)源性的血管生成機(jī)制，不足以代償缺血區(qū)的血氧供應(yīng)，需藥物干預(yù)的手段促進(jìn)血管生成，這就為中藥作用于血管新生及信號(hào)通路的研究，提供了廣闊的前景。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，從模型大鼠缺血區(qū)和半暗帶α-SMA、PI3K

3、、Akt1的表達(dá)變化來(lái)探討老齡大鼠腦缺血/再灌注后微血管生成的特點(diǎn)及中藥制劑對(duì)老齡大鼠腦缺血/再灌注微血管生成的影響及可能的作用機(jī)制，這對(duì)深入探討老年缺血性腦血管疾病的病理生理特點(diǎn)，探索中醫(yī)藥治療缺血性腦血管疾病的作用途徑，具有重大的社會(huì)意義及科學(xué)價(jià)值。
　　目的：
　　1、通過(guò)觀察青年模型組、老齡模型組、尼莫地平組、腦脈通組大鼠腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d后腦組織損傷的病理變化，揭示老齡大鼠腦

4、I/R損傷的特點(diǎn)及腦脈通對(duì)其的腦保護(hù)作用；
　　2、通過(guò)研究青年模型組、老齡模型組、尼莫地平組、腦脈通組大鼠腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d大腦皮質(zhì)區(qū)半暗帶微血管α-SMA表達(dá)變化，揭示老齡大鼠I/R腦微血管生成的特點(diǎn)及腦脈通對(duì)其影響；
　　3、通過(guò)研究青年模型組、老齡模型組、尼莫地平組、腦脈通組大鼠腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d大腦皮質(zhì)區(qū)半暗帶PI3K、Akt1表達(dá)變化

5、，揭示老齡大鼠I/R微血管生成的可能機(jī)制及腦脈通對(duì)其影響。
　　方法：
　　1、采用MCA線栓法制備大鼠局灶性腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d動(dòng)物模型，通過(guò)光鏡等技術(shù)觀察各組大鼠在腦I/R后不同時(shí)間點(diǎn)大腦皮質(zhì)腦組織損傷的病理特點(diǎn)，進(jìn)一步探討腦脈通對(duì)老齡大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織病理改變的影響。
　　2、采用MCA線栓法制備大鼠局灶性腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d動(dòng)

6、物模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法比較各組大鼠在 I3h、I/R1d、I/R3d、I/R6d、I/R12d后大腦皮質(zhì)區(qū)半暗帶微血管α-SMA的表達(dá)變化，研究腦脈通對(duì)老齡大鼠缺血再灌注后微血管α-SMA表達(dá)變化的影響。
　　3、采用MCA線栓法制備大鼠局灶性腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d動(dòng)物模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法比較各組大鼠腦缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d后大腦皮質(zhì)區(qū)半暗帶PI3K、Akt1表達(dá)變化

7、，研究腦脈通對(duì)老齡大鼠缺血再灌注后腦組織 PI3K、Akt1表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1、老齡大鼠 I/R腦組織損傷的病理觀察及腦脈通對(duì)其的影響
　　通過(guò)常規(guī) HE染色，光鏡下觀察模型組大腦皮質(zhì)缺血中心區(qū)與半暗帶區(qū)腦組織損傷的病理變化發(fā)現(xiàn)，在 I3h開始出現(xiàn)組織水腫；I/R24h、I/R3d天時(shí)水腫程度較嚴(yán)重，神經(jīng)纖維紊亂，血管間隙增寬；I/R6d時(shí)水腫達(dá)到高峰，同時(shí)可見大量神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞變性壞死，微血管壁破壞

8、；I/R12d時(shí)水腫基本消失，神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)纖維減少，壞死液化灶出現(xiàn)。與青年模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，老齡模型水腫出現(xiàn)早，組損傷較嚴(yán)重，恢復(fù)速度較慢；與老齡模型組相同時(shí)間點(diǎn)相比，腦脈通組和尼莫地平組病理組織損傷較輕。
　　2、老齡大鼠腦I/Rα-SMA蛋白表達(dá)時(shí)程變化及腦脈通對(duì)其表達(dá)的影響
　　通過(guò)免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)：青年和老齡假手術(shù)組均可見α-SMA弱陽(yáng)性表達(dá)；青年模型組I24h陽(yáng)性表達(dá)開始上升，隨著I/R時(shí)間點(diǎn)的變化，

9、陽(yáng)性表達(dá)呈上升趨勢(shì)，I/R6d、12d維持在較高水平；與青年模型組比較，老齡模型組 I3h、I/R24h、I/R3d、I/R12d表達(dá)均低于青年模型組（P<0.05，P<0.01）；與老齡模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，腦脈通組和尼莫地平組α-SMA陽(yáng)性表達(dá)均高于老齡模型組（P<0.05）。3老齡大鼠腦I/R PI3K、Akt1蛋白表達(dá)時(shí)程變化及腦脈通對(duì)其表達(dá)的影響
　　通過(guò)免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)：青年和老齡假手術(shù)組均可見 PI3K弱陽(yáng)性表達(dá)；青年

10、模型組I24h陽(yáng)性表達(dá)開始上升，隨著I/R時(shí)間點(diǎn)的變化，陽(yáng)性表達(dá)呈上升趨勢(shì)，I/R6d達(dá)到峰值，I/R12d呈降低趨勢(shì)；與青年模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，老齡模型組陽(yáng)性表達(dá)均較低（P<0.05）；與老齡模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，腦脈通組和尼莫地平組各時(shí)間點(diǎn) PI3K陽(yáng)性表達(dá)均高于老齡模型組（P<0.01）。
　　青年和老齡假手術(shù)組均可見Akt1弱陽(yáng)性表達(dá)；青年模型組I24h陽(yáng)性表達(dá)開始上升，隨著I/R時(shí)間點(diǎn)的變化，陽(yáng)性表達(dá)呈上升趨勢(shì)，I/R

11、6d達(dá)到峰值，I/R12d呈降低趨勢(shì)；與青年模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，老齡模型組 Akt1陽(yáng)性表達(dá)均較低（P<0.05）；與老齡模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，腦脈通組和尼莫地平組各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性表達(dá)均高于老齡模型組（P<0.01）；與尼莫地平組相同時(shí)間點(diǎn)比較，腦脈通組陽(yáng)性表達(dá)高于尼莫地平組（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.在遭受相同條件的I/R損傷時(shí)，與青年模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，老齡模型組大鼠損傷出現(xiàn)較早，損傷較重，恢復(fù)慢。與老齡模型

12、組相同時(shí)間點(diǎn)比較，腦脈通組及尼莫地平組組織病理?yè)p傷程度較輕，尤以腦脈通組大鼠腦組織損傷程度最輕，修復(fù)最快，提示腦脈通可明顯改善老齡大鼠腦I/R后組織的損傷。
　　2.老齡大鼠腦 I/R損傷后，腦組織內(nèi)可見微血管生成標(biāo)記物α-SMA蛋白的表達(dá)，且隨腦 I/R時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增多；與老齡模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，腦脈通組及尼莫地平組α-SMA蛋白的表達(dá)水平增高，尤以腦脈通組顯著，提示腦脈通促進(jìn)老齡大鼠腦 I/R后微血管生成。